How cytolytic T-cells recognize their targets; Establishing a molecular imaging approach

Cytotoxische T-Zellen (CTL) sind wichtige Effektorzellen des adaptiven Immunsystems. Ihre Aktivierung geschieht effizient, hoch selektiv, und wird durch die Erkennung MHC-gebundener antigenischer Peptide, die auf Antigen präsentierenden Zellen (APCs) präsentiert werden, durch den T-Zell Antigen Rezeptor (TCR) initiiert. Trotz substantiellen Forschungsaufwands, wird noch nicht verstanden wie CTLs verschwindend geringe Mengen antigenischem pMHC mit hoher Spezifität entdecken können, obwohl ihre TCRs nur niedrige Affinitäten für diese zeigen. Ein Grund dafür ist, dass die Antigenerkennung im Kontext eines kleinen, transienten, aber hochkomplexen Zell-Zellkontaktes stattfindet, der sogenannten immunologischen Synapse. Non-lineare, zelluläre Attribute, wie zum Beispiel die Kompartimentierung der Zellmembran, interzelluläre Kräfte, als auch akzessorische Moleküle, welche alle nicht durch konventionelle biochemische Methoden bestimmt werden können, bestimmen die Umstände in denen synaptische Rezeptor-Liganden Interaktionen stattfinden, und beeinflussen deren Konsequenzen. Im Huppa Lab verwenden wir hoch auflösende, Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie um synaptische, i.e. in situ, TCR-pMHC Interaktionen mittels eines Förster Resonanz Energie Transfer (FRET)-basierten assays darzustellen, und zu quantifizieren. Dabei konfrontieren T-Zellen Glas-gestützte Doppellidschichten, welche uns als simulierte APC Membranen dienen, und die Applikation von signallärmarme Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Mikroskopie ermöglichen. Das Binden von CD8 co-receptor Molekülen an eine nicht-polymorpe Region im MHC Molekül macht T-Zellen sensitiver für Antigen. Um diesen Umstand untersuchen zu können und zu verstehen, habe ich auch mutierte pMHC, die CD8 nicht binden können, produziert. Meine Arbeit verfolgte hauptsächlich das Ziel, funktionierende pMHC zu erzeugen und deren Tauglichkeit als Mikroskopiesonden zu testen.Cytolytic T-cells (CTLs) are major effectors of adaptive immunity. Their activation happens typically in an efficient and highly selective manner and is initiated through T-cell receptor (TCR) - mediated recognition of MHC molecule-embedded antigenic peptides (pMHCs) presented by antigen presenting target cells (APCs). Despite substantial research efforts we still do not understand how CTLs manage to detect trace amounts of antigenic pMHCs with high specificity, despite rather low affinities TCRs typically exert for cognate pMHC ligands. A major reason for this is that antigen recognition takes place within the narrow confines of a transient yet complex cell-cell contact, termed the immunological synapse. Here non-linear cellular properties, such as membrane compartmentalization, cellular forces and accessory molecules, which cannot be accounted for by conventional biochemistry, define the circumstances under which synaptic receptor-ligand interactions take place and influence their outcome. In theHuppalab we apply highly resolving single-molecule fluorescence microscopy to monitor and quantitate synaptic TCR-pMHC binding in situ via a Förster resonance energy transfer (FRET)-based assay established in the lab. For this T-cells are confronted with functionalized glass-supported lipid bilayers, which act as surrogate APC membranes and enable the use of noise-attenuated total internal reflection (TIRF) microscopy. Simultaneous CD8-co-receptor binding to a non-polymorphic region within the MHC molecule is known to sensitize T-cells for antigen. To better understand their mechanisms of action I produced mutant pMHCs deficient in CD8-binding. My efforts were largely devoted to the production and functional testing of pMHC class I molecules specifically designed for high resolution microscopy.eingereicht von Paul SpechtlArbeit an der Bibliothek noch nicht eingelangt - Daten nicht geprüftAbweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersMedizinische Universität Wien, Diplomarb., 2018(VLID)253694