Proteo-Lipobeads : a novel platform to investigate strictly oriented membrane proteins in their functionally active form. Bio-UV-SPR: exploring the ultraviolet spectral range for water-bound analytes in surface plasmon resonance spectroscopy

The present thesis comprises two independent parts, the first one (Proteo-Lipobeads) representing approximately 80 % of the work, whereas the remaining 20 % are covered by the second topic (Bio-UV-SPR). Membrane proteins, which need to be embedded in cell membranes or biomimetic membrane systems to provide function, are the target of many diseases. In the present work, proteo-lipobeads, which overcome the disadvantages of cells, liposomes, and solid-supported bilayer lipid membranes are introduced as a complementary system that enlarges the spectrum of possible investigation methods. Proteo-lipobeads consist of spherical core particles determining their final size, the proteins of interest, which are oriented by attachment via his-tag technology, and a protein-tethered membrane, which is assembled by detergent removal via dialysis in the presence of the desired lipids. In this work, model proteins of the respiratory chain, cytochrome c oxidase and the cytochrome bc1 complex, are investigated. The results clearly indicate that the established membrane is dense, the proteins retain their functionality, and that the proteo-lipobead components constitute a modular system. The applicability in high-throughput assays, a certain storage stability, and the possibility to integrate systems that are more complex is evidenced. Besides the micrometer-sized agarose-based proteo-lipobeads, investigated by fluorescence microscopy, a nanometer-sized version is introduced using silica particles to enable UV/Vis spectroscopy. The results are documented by four publications. In the second part, the commonly used surface plasmon resonance spectroscopy setup was improved to overcome limitations that preclude analyses of water-bound samples at absorption maxima below 350 nm. The answer to this problem is an aluminum grating excited by a white light source as demonstrated on a model protein. The results are documented in a research article.Diese Arbeit umfasst zwei voneinander unabhängige Teile. Der erste repräsentiert ca. 80 %, der zweite ca. 20 % der Arbeit. Viele Krankheiten sind assoziiert mit Membranproteinen. Um diese zu erforschen, müssen sie in eine Membran eingebettet werden, was durch Zellen oder biomimetische Membransysteme umgesetzt werden kann. Durch Proteo-Lipobeads (PLBs) sollen die Nachteile von Zellen, Liposomen und festkörperunterstützten Lipiddoppelschichten überwunden werden. Das Ziel ist nicht der vollständige Ersatz der letzteren, sondern ein ergänzendes System, welches das Spektrum der möglichen Untersuchungsmethoden ergänzt. PLBs basieren auf kugelförmigen Kernpartikeln, welche die finale Größe bestimmen, den Membranproteinen, die durch His-Tag-Technologie gerichtet angebunden werden und einer proteingebundenen Membran, welche durch die Entfernung des Detergenz mittels Dialyse in Anwesenheit von Lipiden präpariert wird. In dieser Arbeit werden die Cytochrom-c-Oxidase und der Cytochrom-bc1-Komplex aus der Atmungskette als Modellproteine verwendet. Die Resultate zeigen, dass die Membran dicht ist, die Proteine ihre Funktionalität bewahren und die PLB-Komponenten ein Baukastensystem darstellen. Die Anwendbarkeit in Hochdurchsatz-Analysen, eine gewisse Haltbarkeit und die Integration eines komplexeren Enzymsystems werden demonstriert. Neben den mikrometergroßen Agarose-PLBs für die Fluoreszenz-Mikroskopie wird eine nanometergroße Version basierend auf Silica-Partikeln vorgestellt, die UV/Vis-Spektroskopie ermöglicht. Die Resultate sind in vier Publikationen dokumentiert. Der zweite Teil befasst sich mit Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie. Der herkömmliche Messaufbau ermöglicht keine Analyse von wassergebundenen Proben mit Absorptionsmaxima unter 350 nm. Wie anhand eines Modellproteins gezeigt wird, kann das Problem durch ein Aluminiumgitter, angeregt durch eine Weißlichtquelle, überwunden werden. Die Ergebnisse sind in einer Publikation dokumentiert