Molecular characterisation of the transcription factor – chromatin landscape interplay during neuronal cell fate acquisition

A multicellular organism consists of a huge variety of different cell types that are all derived from the totipotent zygote. In order to achieve the creation of such diversity from a single cell, a fine-tuned regulation of the genomic output is essential. With regard to gene regulation it is increasingly appreciated that cell fate changes are coordinated by multiple regulatory layers on both, the genetic as well as the epigenetic level. The concerted action of both layers integrates cell-intrinsic and cell-extrinsic cues during development to enable for dynamic cellular responses that become manifested in differential gene expression profiles. This thesis focused on the molecular regulation of cell fate changes during embryonic neuronal differentiation in Mus musculus. Although several transcription factors and epigenetic mechanisms have been described in the context of embryonic neurogenesis, a full understanding yet remains elusive. In this thesis, molecular biology and neurobiology techniques were applied in addition to high-throughput sequencing technologies and computational analyses to explore the impact of two neuron-specific transcription factors on the developmental chromatin landscape. The first part of this thesis investigated the transcription factor NeuroD1. This protein was found to occupy cis-regulatory elements of neuronal genes in a sequence specific fashion. Interestingly, a significant fraction of such genomic loci were embedded in an inactive chromatin landscape prior to NeuroD1’s binding. NeuroD1’s occupancy of these sites initiated their conversion into an active euchromatin state and hence led to the induction of the neuronal developmental program. Several identified NeuroD1 target genes encompassed transcriptional regulators, suggesting that this protein initiated a cascade of nuclear factors that further mediated neuronal fate determination. Strikingly, the transient action of NeuroD1 was sufficient to induce a sustained shape of the neuronal chromatin landscape that persisted after its disappearance during later stages of development. This characterisation of NeuroD1’s molecular function suggested that it might act as a pioneer transcription factor. In the second part of this thesis Zfp354c was identified as a novel KRAB-zinc-finger protein that interacted with KAP1 to confer H3K9me3-mediated silencing of repetitive elements during neurogenesis. Both, its depletion in vitro and in vivo, impaired neuronal differentiation, possibly due to the de-repression of endogenous retroviral elements. In summary, this thesis provides novel insights into coordinated chromatin landscape dynamics during neuronal cell fate acquisition and advocates for the importance of both, the coding as well as the non-coding genome, during this process. These findings open new avenues for the understanding of regulated cellular differentiation and their underlying transcriptome dynamics in the context of neurogenesis. This knowledge can potentially be used for therapeutic reprogramming attempts to ectopically restore degenerated neuronal cell populations.Ausgehend von einer einzigen totipotenten Zygote wird eine Vielzahl mannigfaltiger Zelltypen gebildet aus denen letztlich ein lebensfähiger, mehrzelliger Organismus hervorgeht. Um dies sicher zu stellen bedarf es einer fein abgestimmten Regulation des genomischen Outputs. Zahlreiche Studien zu dieser Thematik verdeutlichen, dass Veränderungen des zellulären Entwicklungsweges sowohl genetisch als auch epigenetisch über mehrere regulatorische Mechanismen koordiniert werden. Ein engmaschig reguliertes Netzwerk von aufeinanderfolgenden Prozessen integriert hierbei sowohl zellintrinsische als auch zellextrinische Signale während des Entwicklungsprozesses, um dynamische zelluläre Antworten in differentiellen Genexpressionsprofilen zu manifestieren. In der vorliegenden Dissertation wurden schwerpunktmäßig die Mechanismen der molekularen Regulation von zellulären Entwicklungsschicksalen während der embryonalen neuronalen Differenzierung in Mus musculus behandelt. Obwohl im Kontext der embryonalen Neurogenese bereits eine Vielzahl an Transkriptionsfaktoren und die Bedeutung epigenetischer Mechanismen beschrieben wurden, ist ein umfassendes Verständnis aller beteiligten Faktoren sowie deren Zusammenspiel im zeitlichen und räumlichen Kontext nicht umfassend verstanden. Daher wurden neben Hochdurchsatz- Sequenzierungstechnologien und bioinformatischen Analysen molekularbiologische und neurobiologische Techniken eingesetzt, um den Einfluss zweier neuronen-spezifischer Transkriptionsfaktoren auf die entwicklungsimmanente Chromatinlandschaft zu untersuchen. Der erste Teil dieser Arbeit untersuchte den Transkriptionsfaktor NeuroD1. Die durchgeführten Versuche ergaben, dass dieses Protein sequenzspezifisch an cis-regulatorische Elemente von neuronalen Genen bindet. Interessanterweise waren eine Vielzahl dieser genomischen Abschnitte vor der NeuroD1-Bindung in einer inaktiven Chromatinlandschaft eingebettet. Die Bindung von NeuroD1 an diese Elemente initiierte deren Umwandlung in einen aktiven Chromatinzustand und führte dabei zur Induktion des neuronalen Entwicklungsprogramms. Mehrere identifizierte NeuroD1-Zielgene umfassten weitere Transkriptionsregulatoren, was nahelegt, dass dieser Faktor eine Kaskade von nuklearen Faktoren aktiviert, die den neuronalen Entwicklungsweg weiter bestimmen. Interessanterweise war die transiente Wirkung von NeuroD1 ausreichend, um eine nachhaltige Manifestation der neuronalen Chromatinlandschaft zu induzieren, die auch in dessen Abwesenheit in der späteren Entwicklung bestehen bleibt. Diese Charakterisierung der molekularen Funktion von NeuroD1 deutete darauf hin, dass es sich um einen Pionier-Transkriptionsfaktor handeln könnte. Der zweite Teil dieser Dissertation identifizierte Zfp354c als ein neues KRAB-Zink-Finger-Protein das mit KAP1 interagiert, um eine H3K9me3-vermittelte Repression repetitiver genomischer Elemente während der Neurogenese zu gewährleisten. Sowohl seine In-vitro- als auch In-vivo-Depletion beeinträchtigte neuronale Differenzierungsprozesse, möglicherweise aufgrund der Reaktivierung von endogenen retroviralen Elementen. Zusammengefasst liefert diese Dissertation neue Einblicke in die Mechanismen und Dynamiken der Modulation der Chromatinlandschaft während der Etablierung einer neuronalen Zellidentität und verdeutlicht die Bedeutung sowohl des kodierenden als auch des nicht kodierenden Genoms in diesem Prozess. Diese Erkenntnisse tragen zum umfassenderen Verständnis der Regulation zellulärer Differenzierung und ihrer zugrundeliegenden Transkriptomdynamiken im Kontext der Neurogenese bei. Dieses Wissen kann möglicherweise für therapeutische Reprogrammierungsversuche verwendet werden, um degenerierte neuronale Zellpopulationen ektopisch wiederherzustellen