Struktur- und Faltungsuntersuchungen am majoren Lichtsammelkomplex II mittels Elektronen-Paramagnetischer-Resonanz (EPR)

Membranproteine haben einen Anteil von 30% an bisher sequenzierten Genomen und bieten Ansatzpunkte für mehr als 50% der bekannten Arzneimittel (Heyden et al. (2012)). Daher ist die Erforschung von Struktur, Funktion und Faltung wichtig für das Verständnis des Metabolismus von Tieren und Pflanzen. Aufgrund der Einbettung in biologischen Membranen mit stark hydrophobem Kern und amphiphilen peripheren Bereichen stellen Untersuchungen an integralen Membranproteinen bis heute ein experimentelles Problem dar. Der majore Lichtsammelkomplex II (LHCII) aus Pisum sativum ist ein ideales Modellobjekt für Analysen von Struktur und Faltung von Membranproteinen, da er nicht nur rekombinant exprimiert und in vitro in Detergenzmizellen rekonstituiert werden kann, sondern mit einer hohen Rückfaltungsdauer von fünf Minuten detaillierte Einblicke in die Assemblierung erlaubt. Während dem Faltungsprozess bindet er acht Chl a, sechs Chl b und vier Carotinoide, und kann daher auch Informationen über Ligandenbindungsprozesse liefern. In der vorliegenden Arbeit wurden mithilfe von zeitaufgelöster Paramagnetischer-Resonanzspektroskopie Strukturuntersuchungen und Faltungsanalysen am LHCII durchgeführt. Die Kombination eines kommerziellen "Stopped-Flow"-Systems mit einer an der ETH Zürich entworfenen "Freeze-Quench"-Einheit erlaubte es, doppelt spinmarkierte Komplexe in verschiedenen Faltungstadien zu konservieren und im DEER-Verfahren die Abstandsentwicklung der markierten Domänen zu messen. Die Ergebnisse zeigten einen Faltungsverlauf, der dem "Three-Stage-Model" von Engelman et al. (2003) entsprach, jedoch auf das separate Ablaufen dieser drei Phasen für einzelne Domänen des LHCII hinwies. Helikale Domänen bildeten sich sehr früh aus, während sich die Ausrichtung der lateralen Schleifendomänen über die gesamte Faltungsdauer hinzog. Abstandsmessungen von markierten Domänen des vollgefalteten Komplex wurden zur Analyse zweier flexibler Bereiche des LHCII herangezogen: Der lumenalen Schleife zwischen den Aminosäuren 96 und 113 und den in der Kristallstruktur nicht aufgelösten ersten zehn Aminosäuren der N-proximalen Sequenz. Für die lumenale Schleife konnte eine hohe Flexibilität abhängig von der Neoxanthinbindung im Monomer nachgewiesen werden, die im trimeren Zustand abnahm. Eine Reihe von Abständen zwischen Positionen nahe dem N-Terminus und Positionen im rigiden Bereich des Proteins wurden verwendet, um den Raum zu modellieren, in dem sich die N-proximale Sequenz mit hoher Wahrscheinlichkeit aufhält. Dieser Unterschied sich zwischen trimerem und monomerem LHCII.Membrane proteins account for more than 50 % of the known drug targets, while constituting about 30 % of the sequenced genomes (Heyden et al. (2012)). Therefore the investigation of structure, function and folding is crucial for the understanding of the metabolism of animals and plants. Since integral membrane proteins are embedded in biological membranes with a distinctly hydrophobic core and an amphiphilic periphery, experimental approaches for investigating these proteins are difficult. The major light harvesting complex II (LHCII) of Pisum sativum is an ideal model for studying the structure and folding pathway of membrane proteins, thanks to the possibility of recombinant expression, in vitro reconstitution and its relatively slow folding, which takes five minutes to arrive at a fully folded complex. During assembly, eight Chl a, six Chl b, and four carotenoids are bound; thus information of ligand binding processes can also be gathered. In this thesis, time resolved paramagnetic resonance was used to analyze the folding process and the structure of the LHCII. The combination of a commercial "stopped-flow"-system and a homebuilt "freeze-quench"-setup (ETH Zurich) allowed the conservation of doubly spinlabelled complexes in different assembly states and the measurement of distance evolutions in labelled domains. The results revealed a folding pathway in agreement with the Three-Stage-Model by Engelman et al. (2003), though suggesting a differential timing of the three stages for different domains. Helical domains evolved early, while the positioning of the loop domains extended over entire duration of the folding process. Distance distributions of labelled domains in fully folded complexes were analysed to investigate two flexible sections of LHCII apoprotein, the lumenal loop between residue 96 and 113, and the N-proximal sequence of the first ten amino acids, which are not resolved in the crystal structure. For the lumenal loop, a medium or high flexibility could be shown depending on wether or not neoxanthin was bound, respectively, and dropping in the trimerised state. A number of distances between positions near the N terminus and positions elsewhere in the protein were used to model the space in which the N-terminal domain is most likely to reside. This was found to be different in LHCII trimers compared to monomers