Mikrobielle Prozesskontrolle in Biogasanlagen durch Monitoring der Kohlenstoff-Isotopenverhältnisse im Gasbereich

Der zunehmende Anteil von Strom aus erneuerbaren Energiequellen erfordert ein dynamisches Konzept, um Spitzenlastzeiten und Versorgungslücken aus der Wind- und Solarenergie ausgleichen zu können. Biogasanlagen können aufgrund ihrer hohen energetischen Verfügbarkeit und der Speicherbarkeit von Biogas eine flexible Energiebereitstellung ermöglichen und darüber hinaus über ein „Power-to-Gas“-Verfahren bei einem kurzzeitigen Überschuss von Strom eine Überlastung des Stromnetzes verhindern. Ein nachfrageorientierter Betrieb von Biogasanlagen stellt jedoch hohe Anforderungen an die Mikrobiologie im Reaktor, die sich an die häufig wechselnden Prozessbedingungen wie der Raumbelastung im Reaktor anpassen muss. Eine Überwachung des Fermentationsprozesses in Echtzeit ist daher unabdingbar, um Störungen in den mikrobiellen Gärungswegen frühzeitig erkennen und adäquat entgegenwirken zu können. rnBisherige mikrobielle Populationsanalysen beschränken sich auf aufwendige, molekularbiologische Untersuchungen des Gärsubstrates, deren Ergebnisse dem Betreiber daher nur zeitversetzt zur Verfügung stehen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig ein Laser-Absorptionsspektrometer zur kontinuierlichen Messung der Kohlenstoff-Isotopenverhältnisse des Methans an einer Forschungsbiogasanlage erprobt. Dabei konnten, in Abhängigkeit der Raumbelastung und Prozessbedingungen variierende Isotopenverhältnisse gemessen werden. Anhand von Isolaten aus dem untersuchten Reaktor konnte zunächst gezeigt werden, dass für jeden Methanogenesepfad (hydrogeno-troph, aceto¬klastisch sowie methylotroph) eine charakteristische, natürliche Isotopensignatur im Biogas nachgewiesen werden kann, sodass eine Identifizierung der aktuell dominierenden methanogenen Reaktionen anhand der Isotopen-verhältnisse im Biogas möglich ist. rnDurch den Einsatz von 13C- und 2H-isotopen¬markierten Substraten in Rein- und Mischkulturen und Batchreaktoren, sowie HPLC- und GC-Unter¬suchungen der Stoffwechselprodukte konnten einige bislang unbekannte C-Flüsse in Bioreaktoren festgestellt werden, die sich wiederum auf die gemessenen Isotopenverhältnisse im Biogas auswirken können. So konnte die Entstehung von Methanol sowie dessen mikrobieller Abbauprodukte bis zur finalen CH4-Bildung anhand von fünf Isolaten erstmalig in einer landwirtschaftlichen Biogasanlage rekonstruiert und das Vorkommen methylotropher Methanogenesewege nachgewiesen werden. Mithilfe molekularbiologischer Methoden wurden darüber hinaus methanoxidierende Bakterien zahlreicher, unbekannter Arten im Reaktor detektiert, deren Vorkommen aufgrund des geringen O2-Gehaltes in Biogasanlagen bislang nicht erwartet wurde. rnDurch die Konstruktion eines synthetischen DNA-Stranges mit den Bindesequenzen für elf spezifische Primerpaare konnte eine neue Methode etabliert werden, anhand derer eine Vielzahl mikrobieller Zielorganismen durch die Verwendung eines einheitlichen Kopienstandards in einer real-time PCR quantifiziert werden können. Eine über 70 Tage durchgeführte, wöchentliche qPCR-Analyse von Fermenterproben zeigte, dass die Isotopenverhältnisse im Biogas signifikant von der Zusammensetzung der Reaktormikrobiota beeinflusst sind. Neben den aktuell dominierenden Methanogenesewegen war es auch möglich, einige bakterielle Reaktionen wie eine syntrophe Acetatoxidation, Acetogenese oder Sulfatreduktion anhand der δ13C (CH4)-Werte zu identifizieren, sodass das hohe Potential einer kontinuierlichen Isotopenmessung zur Prozessanalytik in Biogasanlagen aufgezeigt werden konnte.rnDue to the arising demand for a sustainable energy supply, a dynamic approach is necessary to equalize peak load times as well as supply gaps of wind power plants and solar systems. In this connection, biogas plants feature a highly operational energetic availability and a maximum of flexibility because of the good storage properties of biogas. In addition, using the power-to-gas technique, short-time overloads of the electricity grid can be balanced by converting electricity to storable methane. However, a demand-driven operation of biogas plants makes high demands on the microbiology since the organisms need to adapt to frequently changing process conditions such as the organic loading rate. To obtain a timely recognition of disturbances within microbial fermentation pathways, a real-time monitoring of the digesters state is indispensable to ensure a timely response. rnrnSo far, microbial community analyses of anaerobic digesters were restricted to time-con¬suming laboratory investigations whose results can only be available time-delayed. In this study, for the first time a laser absorption spectroscope was applied for continuous monitoring of carbon isotopic ratios of CH4 of a full-scale anaerobic digester. As a result, varying δ13C (CH4)-values has been mea¬sured depending on the organic loading rate and the process conditions. Analyzing the natural isotopic fractionation of methanogenic pure culture isolates obtained from the reactor, a specific isotopic signature has been detected for each methanogenic pathway (hydrogenotrophic, acetoclastic and methy¬lotrophic). As a result, isotopic analyses of the biogas may provide a real-time identification of the actual predominant methanogenic processes within the bioreactor. rnrnUsing 13C and 2H isotopically labeled substrates in pure or mixed cultures and batch reactors in combination with chromatographic determinations (HPLC, GC) of the metabolic products, many previously unknown carbon flows affecting the isotopic ratio could be determined. For instance, microbial formation and degradation of methanol up to the final release of CH4 have been proven within a biogas plant fed with renewable resources for the first time. Here, methylotrophic pathways could be reconstructed on the basis of five microbial isolates. Furthermore, CH4 oxidizing bacteria of previously undescribed species have been found by the application of molecular biological methods. Right now, the occurrence of these bacteria had not been assumed due to the low concentrations of O2 within the reactor. rnrnBy constructing a synthetic DNA strain con¬tai¬n¬ing primer binding sites for eleven microbial targets representing important groups within the fermentation process, a novel technique has been established allowing the usage of a uniform copy number standard for real-time PCR analyses. During a range of 70 days, reactor samples have been withdrawn in weekly intervals to gain an insight into the microbiota. The qPCR analyses revealed that the isotopic signature is highly affected by the composition of the microbial population. Besides the detection of the predominant methanogenic pathways, it was possible to identify many bacterial reactions such as syntrophic acetate oxidation, acetogenesis and sulfate reduction on the basis of the δ13C (CH4)-values. As a consequence, it has been shown that a continuous measurement of the carbon isotopic ratio of the biogas in combination with the knowledge of the microbiota has great potential for the application as a no¬vel process monitoring option for biogas plants.r