Evolutionäre Veränderungen in der Nutzung redox-aktiver Aminosäuren und ihre Ursachen

Gewebe, Zellen und speziell Zellkompartimente unterscheiden sich in ihrer Sauerstoffkonzentration, Stoffwechselrate und in der Konzentration an gebildeten reaktiven Sauerstoffspezies. Um eine mögliche Änderung in der Aminosäurennutzung durch den Einfluss von Sauerstoff und seinen reaktiven Spezies untersuchen zu können wurden, Bereiche bzw. Kompartimente der menschlichen Zelle definiert, die einen Referenzrahmen bildeten und bekannt dafür sind, einen relativ hohen Grad an reaktiven Sauerstoffspezies aufzuweisen. Aus dem Vergleich wurde deutlich, dass vor allem die beiden redox-aktiven und schwefeltragenden Aminosäuren Cystein und Methionin durch eine besondere Verteilung und Nutzung charakterisiert sind. Cystein ist hierbei diejenige Aminosäure mit den deutlichsten Änderungen in den fünf untersuchten Modellen der oxidativen Belastung. In all diesen Modellen war die Nutzung von Cystein deutlich reduziert, wohingegen Methionin in Proteinen des Mitochondriums und der Elektronentransportkette angereichert war. Dieser auf den ersten Blick paradoxe Unterschied zwischen Cystein und Methionin wurde näher untersucht, indem die differenzierte Methioninnutzung in verschiedenen Zellkompartimenten von Homo sapiens charakterisiert wurde.rnDie sehr leicht zu oxidierende Aminosäure Methionin zeigt ein ungewöhnliches Verteilungsmuster in ihrer Nutzungshäufigkeit. Entgegen mancher Erwartung wird Methionin in zellulären Bereichen hoher oxidativer Belastung und starker Radikalproduktion intensiv verwendet. Dieses Verteilungsmuster findet man sowohl im intrazellulären Vergleich, als auch im Vergleich verschiedener Spezies untereinander, was daraufhin deutet, dass es einen lokalen Bedarf an redox-aktiven Aminosäuren gibt, der einen sehr starken Effekt auf die Nutzungshäufigkeit von Methionin ausübt. Eine hohe Stoffwechselrate, die im Allgemeinen mit einer erhöhten Produktion von Oxidantien assoziiert wird, scheint ein maßgeblicher Faktor der Akkumulation von Methionin in Proteinen der Atmungskette zu sein. Die Notwendigkeit, oxidiertes Antioxidans wieder zu reduzieren, findet auch bei Methionin Anwendung, denn zu Methioninsulfoxid oxidiertes Methionin wird durch die Methioninsulfoxidreduktase wieder zu Methionin reduziert. Daher kann die spezifische Akkumulation von Methionin in Proteinen, die verstärkt reaktiven Sauerstoffspezies ausgesetzt sind, als eine systematische Strategie angesehen werden, um andere labile Strukturen vor ungewollter Oxidation zu schützen. rnDa Cystein in allen untersuchten Modellen der oxidativen Belastung und im Besonderen in Membranproteinen der inneren Mitochondrienmembran lebensspannenabhängig depletiert war, wurde dieses Merkmal näher untersucht. Deshalb wurde die Hypothese getestet, ob ein besonderer Redox-Mechanismus der Thiolfunktion für diese selektive Depletion einer im Allgemeinen als harmlos oder antioxidativ geltenden Aminosäure verantwortlich ist. Um den Effekt von Cysteinresten in Membranen nachzustellen, wurden primäre humane Lungenfibroblasten (IMR90) mit diversen Modellsubstanzen behandelt. Geringe Konzentrationen der lipophilen Substanz Dodecanthiol verursachten eine signifikante Toxizität in IMR90-Zellen, die von einer schnellen Zunahme an polyubiquitinierten Proteinen und anderen Indikatoren des proteotoxischen Stresses, wie Sequestosom 1 (P62), HSP70 und HSP90 begleitet wurde. Dieser Effekt konnte spezifisch der Chemie der Thiolfunktion in Membranen zugeordnet werden, da Dodecanol (DOH), Dodecylmethylsulfid (DMS), Butanthiol oder wasserlösliche Thiole weder eine cytotoxische Wirkung noch eine Polyubiquitinierung von Proteinen verursachten. Die Ergebnisse stimmen mit der Hypothese überein, dass Thiole innerhalb von biologischen Membranen als radikalische Kettentransferagentien wirken. Diese Eigenschaft wird in der Polymerchemie durch Nutzung von lipophilen Thiolen in hydrophoben Milieus technisch für die Produktion von Polymeren benutzt. Da die Thiylradikal-spezifische Reaktion von cis-Fettsäuren zu trans-Fettsäuren in 12SH behandelten Zellen verstärkt ablief, kann gefolgert werden, dass 12SH zellulär radikalisiert wurde. In lebenden Organismen kann demnach die Oxidation von Cystein die Schädigung von Membranen beschleunigen und damit Einfallstore für die laterale Radikalisierung von integralen Membranproteinen schaffen, welche möglicherweise der Langlebigkeit abträglich ist, zumindest, wenn sie in der inneren Mitochondrienmembran auftritt.Nearly every cell in higher eukaryotes is influenced by oxygen. Oxygen is omnipresent in the environment of almost every higher animal, and it is used to metabolize substrates to gain the majority of the cell´s ATP. On the other side, oxygen is highly reactive when reactive oxygen species are formed as byproducts of the normal energy metabolism. The ensuing oxidative stress can lead to oxidative modifications of amino acid side chains in proteins, which are considered to represent structural damage. Since the chemistry of the amino acids varies in many ways, it was of interest to analyze the differentiated amino acid usage in various models of oxidative stress including organelles and cellular substructures as well physiological factors such as longevity and oxygen consumption. Analyzing the amino acid usage of mitochondrial proteins in 20 different animals, it was found that the two sulfur-containing and redox-active amino acids were employed in an oppositional way. While methionine accumulated in proteins of the respiratory chain, cysteine was depleted in exactly these peptides. rnRegarding the methionine effect, studies on its distribution in 19806 proteins from Homo sapiens revealed a clear tendency of methionine to accumulate in proteins located to the vicinity to high oxidative pressure. The accumulation of methionine in proteins of the electron transport chain and the possibility of methionine sulfoxide reductase to reverse the oxidation of methionine indicates that the purpose of methionine accumulation in proteins in an oxidative environment is to act as a sacrificial cathode. As a consequence, it is likely that an elevated methionine content can protect protein surfaces and the surrounding lipids from getting oxidized under oxidative stress conditions. If there is no or little oxidative stress, for example in anaerobic animals like parasites or anaerobic helminths, no methionine accumulation could be seen.rnRegarding cysteine, to understand the mechanism of the observed cysteine depletion in proteins of the respiratory chain and in other oxidative sites, a series of biochemical experiments were performed. A new model substance, namely dodecylthiol (12SH), was used to reverse the effect of the evolutionary cystein and thus thiol depletion in membrane proteins. Primary human lung fibroblasts (IMR90) were treated with different concentrations of 12SH and different control substances. At low concentrations (10-100 µM), 12SH caused significant toxicity to IMR90 cells, which was accompanied by a rapid increase in the levels of poly-ubiquitinated proteins and other markers of proteotoxic stress like sequestosome 1 (p62), and a delayed upregulation of HSP70 and HSP90 was noted. These effects were specific to the intramembrane accumulation of a thiol group, because dodecyl alcohol (DOH), methylated dodecyl thiol (DMS), butyl thiol (4SH), or other aqueous thiols neither induced cytotoxicity, nor elevated the levels of poly-ubiquitinated proteins. The addition of tocopherol could partially reverse the observed cytotoxicity of 12SH, which could not be achieved by the exogenous addition of catalase or SOD. To study the impact of thiols on lipid peroxidation, isolated brain membranes were treated with 12SH, which alone had no effect, but in combination with low concentrations of radical initiators massively amplified the lipid peroxidation process. To summarize these findings, thiols in biological membranes (and hence cysteine in membrane proteins) seem to possess a highly efficient free radical chain-transfer activity, as known from polymer chemistry. For this reason, cysteine residues might accelerate lipid bilayer decomposition, putatively followed by the lateral radicalization of integral membrane proteins, which might result in selective damage to high-protein, high-oxidant membranes, such as those of the inner mitochondrial membrane