In vitro characterization of human AML-reactive CTL clones generated from the naive subset of healthy donors and adoptive transfer into leukemia-engrafted NSG mice

Acute myeloid leukemia (AML) is a very aggressive cancer of the hematopoietic system. Chemotherapy and immunotherapeutical approaches including hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) and donor lymphocyte infusion (DLI) are the only curative options available. The beneficial graft-versus-leukemia (GVL) effect of cellular immunotherapy is mostly mediated by donor-derived CD8+ T lymphocytes that recognize minor histocompatibility antigens (mHags) and leukemia-associated antigens (LAAs) presented on the surface of AML blasts (Falkenburg et al. 2008; Kolb 2008). A main complication is graft-versus-host disease (GVHD) that can be induced when cytotoxic T lymphocytes (CTLs) recognize broadly expressed antigens. To reduce the risk of GVHD, specific allogeneic T-cell therapy inducing selective GVL responses could be an option (Barrett & Le Blanc 2010; Parmar et al. 2011; Smits et al. 2011). This requires efficient in vitro strategies to generate AML-reactive T cells with an early differentiation phenotype as well as vigorous effector functions and humanized mouse models to analyze the anti-leukemic potential of adoptively transferred T cells in vivo. In this study, AML-reactive CTL clones and oligoclonal T-cell lines could be reliably generated from the naive subset of healthy HLA-class I-identical donors by stimulation with primary AML blasts in mini-mixed-lymphocyte / leukemia cultures (MLLCs) in eight different patient / donor pairs. These CTLs were promising candidates for cellular immunotherapy because of their relatively early differentiation phenotype and strong proliferative and lytic capabilities. The addition of the common γ-chain cytokine IL-21 to the stimulation protocol enabled more precursors to develop into potent leukemia-reactive CTLs, presumably by its beneficial effects on cell survival and antigen-specific proliferation during the first weeks of cultures. It also strengthened the early-stage phenotype. Three long-term cultured CTLs exemplarily transferred into leukemia-engrafted immunodeficient NSG mice mediated a significant reduction of the leukemic burden after a single transfusion. These results demonstrate that CTL clones with reactivity to patient-derived AML blasts can be isolated from the naive compartment of healthy donors and show potent anti-leukemic effects in vivo. The herein described allo-MLLC approach with in vitro “programmed” naive CTL precursors independent of a HSCT setting is a valuable alternative to the conventional method of isolating in vivo primed donor CTLs out of patients after transplantation (Kloosterboer et al. 2004; Warren et al. 2010). This would make leukemia-reactive CTLs already available at the time point of HSCT, when residual leukemia disease is minimal and the chances for complete leukemia eradication are high. Furthermore, leukemia-reactive CTLs effectively expanded by this in vitro protocol can be used as screening populations to identify novel candidate LAAs and mHags for antigen-specific immunotherapy.Akute myeloische Leukämie (AML) ist eine sehr aggressive Krebsart des hämatopoetischen Systems. Chemotherapie und immuntherapeutische Ansätze, welche hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) und Donor-Lymphozyten-Infusion (DLI) beinhalten, sind die einzigen zur Verfügung stehenden kurativen Behandlungsmöglichkeiten. Der bei der zellulären Immuntherapie auftretende förderliche Transplantat-gegen-Leukämie (GVL)-Effekt ist hauptsächlich durch vom Spender stammende CD8+ T-Lymphozyten herbeigeführt, die Minor-Histokompatibilitätsantigene (mHag) und Leukämie-assoziierte Antigene (LAA) erkennen, welche auf der Oberfläche von AML-Blasten präsentiert werden (Falkenburg et al. 2008; Kolb 2008). Eine der Hauptkomplikationen hierbei ist die Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (GVHD), die ausgelöst werden kann, wenn zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) allgemein exprimierte Antigene erkennen. Um das Risiko der GVHD zu vermindern, ist die spezifische allogene T-Zell-Therapie eine Option, welche selektive GVL-Reaktionen auslöst (Barrett & Le Blanc 2010; Parmar et al. 2011; Smits et al. 2011). Hierzu werden effiziente in vitro Strategien zur Generierung von AML-reaktiven T-Zellen mit einem frühen Differenzierungsphänotyp und starken Effektorfunktionen, sowie humanisierte Mausmodelle benötigt, um das anti-Leukämie-Potential der adoptiv transferierten T-Zellen in vivo zu untersuchen. rnIn der vorliegenden Arbeit konnten aus acht verschiedenen Patienten / Spender Paaren AML-reaktive CTL-Klone und oligoklonale CTL-Linien zuverlässig aus dem naiven Kompartiment gesunder HLA-Klasse I-identischer Spender durch Stimulation mit primären AML-Blasten in gemischten mini-Lymphozyten-Leukämiezell-Kulturen (MLLC) generiert werden. Diese CTL waren durch ihren relativ frühen Differenzierungsphänotyp und ihre starken proliferativen und lytischen Eigenschaften vielversprechende Kandidaten für die zelluläre Immuntherapie. Die Zugabe des common γ-chain Zytokins IL-21 zum Stimulationsprotokoll ermöglichte es, dass sich mehr Progenitorzellen zu potenten Leukämie-reaktiven CTL entwickeln konnten, was vermutlich auf den fördernden Effekt des Zytokins auf das Zellüberleben und die Antigen-spezifische Proliferation in den ersten Kulturwochen zurückzuführen war. Ebenso wurde der frühe Phänotyp durch IL-21 verstärkt. Drei Langzeit kultivierte CTL, die exemplarisch in Leukämie-engraftete immundefiziente NSG Mäuse transferiert wurden, führten zu einer signifikanten Reduktion der Leukämielast nach einer einzigen Transfusion. rnDiese Ergebnisse demonstrieren, dass CTL-Klone, die vom Patienten stammende AML-Blasten erkannten, aus dem naiven Kompartiment gesunder Spender isoliert werden konnten und wirksame anti-Leukämie-Effekte in vivo zeigten. Der hier beschriebene allo-MLLC Ansatz mit in vitro „programmierten“ naiven CTL-Progenitorzellen, der unabhängig von der HSCT-Prozedur ist, ist eine wertvolle Alternative zur konventionellen Methode, bei der in vivo aktivierte Spender-CTL nach der Transplantation aus dem Patienten isoliert werden (Kloosterboer et al. 2004; Warren et al. 2010). Dies würde Leukämie-reaktive CTL schon zum Zeitpunkt der HSCT verfügbar machen, wenn die Resterkrankung der Leukämie minimal ist und die Chancen für eine komplette Vernichtung der Leukämiezellen hoch sind. Außerdem können die mit diesem in vitro Protokoll effektiv expandierten CTL als screening-Population genutzt werden, um neue LAA und mHag als Kandidaten für antigen-spezifische Immuntherapie zu identifizieren.r