Das Phosphoproteom von Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs nach Bestrahlung und Applikation des Cyclooxygenase-Inhibitors Flurbiprofen

Ziel: Die Radiotherapie hat in der Behandlung von Plattenepithelkarzinomen des Kopf- und Halsbereichs nach wie vor einen hohen Stellenwert. Der Erfolg eines Therapieregimes, das die Behandlung mit ionisierenden Strahlen einschließt, ist jedoch häufig limitiert durch die Entwicklung radioresistenter Tumorzellpopulationen, die nicht selten durch die Bestrahlung selbst induziert wird. Die Mechanismen, die zu einer solchen bestrahlungsinduzierten Radioresistenz führen sind bisher nur unvollständig verstanden und Methoden, durch die die Entwicklung von Radioresistenz verhindert werden könnte, wie beispielsweise der präventive Einsatz von Pharmazeutika, sind bislang nicht systematisch untersucht. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu überprüfen, ob der Cyclooxygenase-Inhibitor Flurbiprofen durch Bestrahlung induzierte Veränderungen der Phosphoprotein-Expression verstärken oder abschwächen kann und ob sich aus solchen Modifikationen des Bestrahlungsergebnisses ein radioprotektiver Effekt der Flurbiprofenapplikation ableiten lässt. Methoden: Es wurde ein experimenteller Ansatz gewählt, der mittels 2D PAGE und anschließender MALDI-TOF Massenspektrometrie das Phosphoproteom einer HNSCC-Zelllinie unter verschiedenen Bedingungen untersuchte. Die Zellen wurden entweder mit einer Energiedosis von 8 Gy bestrahlt, mit einer 200 μM Flurbiprofen enthaltenden Lösung inkubiert oder sie wurden mit einer Kombination aus Flurbiprofenapplikation und Bestrahlung behandelt. Vor der 2D PAGE wurden die Phosphoproteine durch IMAC angereichert. Zur Verbesserung der Gel-Analytik wurde die Software Delta 2D angewendet, die zum Ausgleich von Laufweitenunterschieden zwischen den Gelen ein Warping vorsieht. Ergebnisse und Diskussion: Bei der Analyse, der unter den verschiedenen experimentellen Bedingungen differentiell exprimierten Phosphoproteinen mittels bioinformatischer Hilfsprogramme wie z.B. WEBGestalt und STRING, wurden sieben Proteine mit Bedeutung für das Wachstum und die Entdifferenzierung von Tumoren identifiziert und einer ausführlichen Literaturrecherche unterzogen. Auf diese Weise konnten die Ergebnisse der für die vorliegende Arbeit durchgeführten Experimente in den systembiologischen Kontext eingeordnet werden. Besonders hervorzuheben ist die Herabregulierung der möglicherweise Radioresistenz vermittelnden Proteine GRP-75, 14-3-3 sigma und CRT sowie die Herabregulierung des anti-apoptotischen und tumor-begünstigenden Hsp60 durch Flurbiprofen. Die Verminderung der Expression unterstreicht das Potential dieses Pharmakons sowie der Klasse der COX-Inhibitoren als mögliche radiosensitivierende und tumorsuppressive Substanzen.Objective: Radiotherapy is still one of the most effective methods for the treament of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). However the success of irradiation is quite often limited by the development of radioresistent cell populations inside the tumor that is inter alia caused by irradiation itself. The mechanisms that cause irradiation induced radioresistance are still widely unknown and methods to prevent its development i.e. the use of drugs for pre- or co-treatment have not yet been systematically examined. The aim of the study at hand was to examine if the cyclooxygenase inhibitor flurbiprofen is able to decrease or increase radiation induced changes in the phosphoproteome expression and if these changes may imply a protective effect of the application of flurbiprofen. Methods: To examine the phosphoproteome of HNSCC cells under different predefined conditions phosphoproteins were enriched from a whole cell lysate by IMAC and afterwards analyzed by 2D PAGE combined with MALDI-TOF mass spectrometry. Cell cultures were either irradiated with an energy dose of 8 Gy or incubated with a solution containing 200 μM flurbiprofen or they were treated by a combination of irradiation and application of flurbiprofen. To analyze differential expression profiles on the 2D gels the software Delta 2D was used. Results and Discussion: By analyzing the differentially expressed phosphoproteins using databases like WEBGestalt and STRING seven proteins with high significance for the development and the increase of malignancy of tumorcells were identified and subjected to a thorough literature research to rank the proteins in the context of systembiology. Of emanating importance considering the effects of flurbiprofen is the decrease of the proteins GRP-75, 14-3-3 sigma and CRT which play a role in the radioresistance of tumors as well as the decrease of hsp60 which is an anti-apoptotic protein that promotes tumor growth. The reduction of these proteins underlines the potential of flurbiprofen and the class of COX-inhbitors as radiosensitzers and tumorsuppressive drugs