Effects of glucocorticoids on vascular NADPH oxidases and endothelial NO synthase

Glukokortikoide (GCs) stellen wichtige Hormone in der Regulation der metabolischen Homöostase dar. Synthetische GCs, wie Dexamethasone (DEX), spielen eine essentielle Rolle in der Behandlung inflammatorischer Krankheiten. Jedoch sind unter einer Dexamethason-Therapie zahlreiche Nebenwirkungen bekannt, so z.B. auch die Entwicklung einer Hypertonie, in deren Pathogenese oxidativer Stress eine entscheidende Rolle spielt. Obwohl sich in den vergangenen Jahren zahlreiche Studien zum Ziel setzten die GC-induzierte Hypertonie (GC-HT) aufzuklären, sind die genauen Mechanismen bis heute unklar. Eine erhöhte Expression von NADPH Oxidasen (Nox) und eine Entkopplung der endothelialen NO Synthase (eNOS), die Hauptquellen reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) im vaskulären System, tragen maßgeblich zur Pathogenese kardiovaskulärer Erkrankungen bei. Daher ist eine Beteiligung dieser Enzyme in GC-induziertem oxidativen Stress sehr wahrscheinlich. Folglich wurde die Hypothese aufgestellt, dass NADPH Oxidasen und eine entkoppelte eNOS die vielversprechendsten unter den zahlreichen involvierten pro- und anti-oxidativen Enzymen sind. Mit Fokus auf die oben genannten Systeme wurde in der vorliegenden Studie der Effekt von DEX mit Hilfe von in vivo (WKY Ratten) ebenso wie in vitro Experimenten (A7r5 und EA.hy 926 Zellen) untersucht. Dabei zeigte sich, dass Nox1, Nox4 und p22phox durch DEX unterschiedlich reguliert wurden. Nox1 wurde hoch-, Nox4 hingegen herunterreguliert, während p22phox unverändert blieb. Die Modufikation schien hierbei auf transkriptioneller und post-transkriptioneller Ebene stattzufinden. Durch die gegensätzliche Regulation von Nox1 und Nox4 bleibt die Nettowirkung der verschiedenen Nox Isoformen unklar. Immer mehr Studien bringen vaskulären oxidativen Stress mit der Pathogenese einer GC-HT in Zusammenhang, welche letztendlich zu einer verminderten Bioverfügbarkeit von Stickstoffmonoxid (NO) führt. Durch die eNOS produziertes NO stellt einen essentiellen Schutzfaktor der Blutgefäße dar. Eine verminderte NO-Bioverfügbarkeit könnte die Folge einer eNOS-Entkopplung darstellen, ausgelöst durch oxidativen Stress. Da die Verfügbarkeit von Tetrahydrobiopterin (BH4) entscheident ist für die Aktivität und enzymatische Kopplung der eNOS, beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit GC-induzierten Veränderungen in der BH4-Versorgung. Die Behandlung von EA.hy 926 Zellen mit DEX führte zu einer zeit- und konzentrationsabhängigen Herunterregulation von eNOS auf mRNA- und Proteinebene. Gleichzeitig wurde die Phosphorylierung an Serine1177 vermindert. Als maßgeblicher “Kopplungs-Schalter” kann BH4 endogen über zwei verschiedene Signalwege synthetisiert werden, welche durch die Enzyme GCH1 und DHFR reguliert werden. DEX führte zu einer zeit- und konzentrationsabhängigen Herunterregulation von BH4, BH2 und Biopterin, wobei ebenso das BH4 / BH2 -Verhältnis vermindert wurde. Beide Enzyme, GCH1 genauso wie DHFR, wurden auf mRNA- und Proteinebene herunterreguliert, was auf einen Effekt von GCs auf beide rnBH4-produzierenden Signalwege schließen lässt. Nach Behandlung mit DEX wurde die Produktion von NO in Endothelzellen maßgeblich vermindert. In ROS-Messungen zeigte sich eine Tendenz hin zu einer eNOS-Entkopplung, jedoch war es mit unserem experimentellen Aufbau nicht möglich, diese endgültig zu beweisen.rnZusammenfassend lässt sich sagen, dass die Behandlung mit GCs zu Veränderungen in beiden untersuchten Systemen, den NADPH Oxidasen ebenso wie dem eNOS-NO System, führte. DEX erhöhte die Expression von Nox1 in glatten Muskelzellen und reduzierte die Nox4-Expression in Endothelzellen. Gleichzeitig verminderte DEX die Verfügbarkeit von BH4 und inhibierte die Phosphorylierung / Aktivität von eNOS. Mithilfe weiterer Studien muss die endgültige Beteiligung von NADPH Oxidasen und einer eNOS-Entkopplung an oxidativem Stress in GC-HT abschließend aufgeklärt werden.rnGlucocorticoids (GCs) are important hormones in the regulation of metabolic homeostasis. Synthetic GCs, such as dexamethasone (DEX), play a fundamental role in the treatment of inflammatory diseases. There are numerous side effects of a DEX therapy, e.g. the development of hypertension, in whose pathogenesis oxidative stress is a crucial factor. Although numerous studies in recent years addressed the question how GCs induce hypertension, precise mechanisms still remain unknown. An increased expression of Nox enzymes and an uncoupling of endothelial NO synthase (eNOS), the main sources of reactive oxygen species (ROS) in the vascular system, significantly contributes to the pathogenesis of cardiovascular diseases, thus a participation of these enzymes in GC-induced oxidative stress seemed likely. Therefore, we hypothesized that NADPH oxidases (Nox) and an uncoupled eNOS are most the promising enzymes among the numerous different pro- and anti-oxidative enzymes involved. Focusing on those two systems, the present study investigated the effect of DEX in both in vivo (WKY rats) as well as in vitro experiments (A7r5 and EA.hy 926 cells). Nox1, Nox4 and p22phox were found to be differentially regulated by DEX with Nox1 being upregulated, Nox4 downregulated and p22phox unchanged. This regulation seems to occur at both transcriptional and post- transcriptional levels. As Nox1 and Nox4 were reciprocally regulated by DEX, the net effect of the different Nox enzymes is uncertain. There is increasing evidence implicating vascular oxidative stress in the pathogenesis of glucocorticoid-induced hypertension (GC-HT), leading to decreased nitric oxide (NO) bioavailability. NO generated by the eNOS is an essential protective factor of the vasculature. A reduced NO bioavailability might be the consequence of a possibly uncoupled eNOS, triggered by elevated oxidative stress. Since tetrahydrobiopterin (BH4) availability is a crucial regulator of eNOS activity and enzymatic coupling, this study addressed modifications in the supply of BH4 through GCs. DEX treatment of EA.hy 926 cells caused a time- and concentration-dependent downregulation of eNOS on mRNA and protein level and diminished its phosphorylation at serine1177. BH4 as the major “coupling switch” can be synthesized endogenously by two different pathways, depending on GCH1 and DHFR as the rate limiting enzymes. In a time- and concentration-dependent manner DEX decreased BH4, BH2 and total biopterin levels, as well as the BH4 / BH2 ratio. Both enzymes GCH1 and DHFR were downregulated on mRNA and also protein level, showing that GCs affect both BH4-producing pathways. Also NO production was massively decreased after DEX treatment. In ROS measurements, we found a tendency of eNOS uncoupling. Clear evidence for eNOS uncoupling, however, could not be demonstrated under our experimental setting. rnIn summary, GC treatment leads to changes in both the vascular NADPH oxidase and the eNOS-NO system. DEX upregulates Nox1 in smooth muscle cells and reduces Nox4 in endothelial cells. In parallel, DEX decreases BH4 availability and inhibits eNOS phosphorylation / activity. The ultimate contribution of Nox enzymes and uncoupled eNOS to oxidative stress in GC-HT needs to be clarified in future studies.r