Modifizierungen des Enzyms Silicatein alpha zur direkten Immobilisierung auf verschiedenen Oberflächen : neuartige Herstellung von Kompositmaterialien unter physiologischen Bedingungen

Das Silicatein α ist ein 24 kDa großes Enzym, welches im Schwamm Suberites domuncula für die Synthese von Biosilikat verantwortlich ist. Vorhergehende Studien haben gezeigt, dass Silicatein auch die Synthese anderer Metalloxide wie Titandioxid, Galliumoxid und Zirkoniumdioxid katalysieren kann. Diese Fähigkeiten machen das Silicatein α für biomedizinische und biotechnologische Anwendungen interessant, da die Synthese unter nahezu physiologischen Bedingungen ablaufen kann, was die Herstellung neuartiger Kompositmaterialien mit einzigartigen Eigenschaften erleichtern würde. Zur Immobilisierung des Silicatein α auf verschiedenen Oberflächen wurde bislang ein Nickel-NTA-Kopolymer eingesetzt. Diese Art der Immobilisierung bietet eine Reihe von Möglichkeiten in der Nanobiotechnologie, stößt aber in der Biomedizin an ihre Grenzen, da sich nicht alle Oberflächen für ein solches Coating eignen. Zudem können die zur Aktivierung des Polymers nötigen Lösungsmittel und die über die Zeit freigesetzten Monomere aus dem Polymergerüst toxische oder mutagene Wirkung auf das umliegende Gewebe haben. Deshalb wurde das Silicatein α in dieser Arbeit mit zwei Affinitäts-Tags so modifiziert, dass es an verschiedene Oberflächen immobilisiert werden kann und dabei seine Aktivität beibehält. Zuerst wurde das Silicatein mit einem Glu-tag am N-terminalen Ende modifiziert. Dadurch gelang die direkte Immobilisierung an Hydroxyapatit und die folgende, enzymkatalysierte Synthese von Biosilikat-Beschichtungen auf diesem Träger. Die Eigenschaften eines solchen HA-Kompositmaterials können zum Beispiel zu einem verbesserten, schnelleren und stabileren Einwachsen von Knochenimplantaten führen, da Biosilikat die Reifung und Differenzierung von Osteoblasten beschleunigt. rnMit dem an Hydroxyapatit-Plättchen immobilisierten Glu-tag-Silicatein wurde ein modifizierter Pull-down Assay etabliert, wodurch bekannte, aber auch bis dahin noch unbekannte Protein-Interaktionspartner identifiziert werden konnten. rnUm zu zeigen, dass der entwickelte Glu-tag an präformierte, calciumhaltige Oberflächen binden kann, wurden die Nadeln des Kalkschwammes Paraleucilla magna als Modellorganismus verwendet. Die Nadeln konnten durch das immobilisierte Silicatein mit einer Titandioxid-Schicht überzogen werden und unter Verwendung des Interaktionspartners Silintaphin-1 konnte diese Beschichtung noch verstärkt werden. Solche CaCO3-Kompositmaterialien könnten sowohl in der Biomedizin als auch in der Biotechnologie zum Einsatz kommen. Neben den erwähnten calciumhaltigen Materialien finden auch andere Stoffe wie TiO2-Nanodrähte Verwendung in der Forschung. In weiterführenden Experimenten konnte gezeigt werden, dass der entwickelte Glu-tag auch Affinität zu Titandioxid-Oberflächen vermittelt. Auch hier konnte durch das oberflächenimmobilisierte Enzym eine Biosilikatbeschichtung synthetisiert werden. rnMit der zweiten Modifikation - einem Cys-tag - konnte Silicatein direkt auf Goldoberflächen immobilisiert werden. Durch die Verwendung eines Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempels wurde das Cys-getaggte Silicatein in einem linienförmigen Muster auf das Gold übertragen und die Synthese von Titandioxid dort nachgewiesen.rnDie Experimente und Ergebnisse dieser Arbeit haben gezeigt, dass Silicatein α durch einfache Modifikationen an verschiedene Oberflächen immobilisiert werden kann und dabei immer noch seine Aktivität behält. rnHierdurch ergibt sich die Möglichkeit, unter Normalbedingungen verschiedenste Kompositmaterialien herzustellen.rnSilicatein-α is a 24 kDa enzyme, which is in the sponge Suberites domuncula responsible for the synthesis of biosilica. Previous studies have shown that silicatein can also catalyze the synthesis of other metal oxides such as titanium dioxide, gallium oxide and zirconia. The flexibility of the enzyme makes it interesting for biomedical and biotechnological applications since the synthesis of the materials is carried out under nearly physiological conditions, which would facilitate the production and biocompatibility of novel composite materials with unique properties.rnSo far for immobilization of silicatein-α on different types of surfaces, a nickel-NTA-copolymer has been used. This type of immobilization can be well applied in nanotechnology, but as its limits in biomedical applications since not all surfaces are suitable for such coatings. rnIn addition, solvents are necessary for the functionalization and activation of these types of polymers and monomer released over time from the polymer backbone have potential mutagenic or toxic effects to the surrounding tissues. rnTherefore in this work, silicatein-α was modified with two affinity tags so that it is possible to immobilize it on different surfaces, while retaining its activity. rnFirst silicatein was modified with a glutamate-tag (Glu-tag) at the N-terminal end. The direct immobilization of the protein on hydroxyapatite (HA) could be demonstrated and further biosilica coatings could be achieved, showing that the enzyme remains active after immobilization.rnThe properties of such a composite material, like for example, HA lead to an improved, faster and more stable cell ingrowth on bone implants, as biosilica accelerates the maturation and differentiation of osteoblasts.rnWith Glu-tag-silicatein immobilized on hydroxyapatite platelets, a modified pull-down assay was established where known and unknown interaction partners of silicatein-α could be detected. To show that the Glu-tag silicatein can bind to other calcium containing surfaces, spicules from the calcarea sponge Paraleucilla magna were used as a model organism. The spicules were functionalized with Glu-tag silicatein which could further catalyze the formation of titanium dioxide. By using silicatein´s interaction partner, silintaphin-1 thicker coatings of titanium dioxide could be obtained. Such CaCO3 composite materials could be used both in biomedicine and biotechnology for example. rnAlong with the aforementioned calcium-containing materials are also other materials such as TiO2 nanowires were used in this work. In further experiments it could be shown that the developed Glu tag has also affinity to titanium dioxide surfaces. Here, too, the surface-immobilized enzyme could synthesize a biosilica layer.rnWith the second modification – a cysteine-tag (Cys-tag) - silicatein could be directly immobilized on gold surfaces. Through the use of microcontact printing with polydimethylsiloxane (PDMS) stamps Cys-tagged silicatein was printed in a linear pattern on gold surfaces and was further active for the synthesis of titanium dioxide.rnThe experiments and results of this study have shown that silicatein α can be immobilized by simple modifications to various surfaces and still retains its activity.rnThis results in the possibility of producing a variety of composite materials under physiological conditions.r