Bioverkapselung lebender Bakterien (Escherichia coli) mit Poly-(Silicat) nach Transformation mit dem Silicatein-alpha-Gen

Die Bioverkapselung ist eine faszinierende Methode, um biologische Materialien einschließlich Zellen in Siliziumdioxid, Metalloxiden oder hybriden Sol-Gel-Polymeren zu immobilisieren. Bisher wurde nur die Sol-Gel-Vorläufertechnologie genutzt, um Bakterien- oder Hefezellen in Siliziumdioxid zu immobilisieren. Hierfür wurden verschiedene Reagenzien als wässrige Vorläufer getestet, um poly(Silicate) auf Biomolekülen (Bhatia et al., 2000) oder Zellen (Liu und Chen 1999; Coradin und Livage, 2007) zu bilden. Einer der erfolgreichsten bisherigen Methoden verwendet eine Mischung aus Silicaten und kolloidalem Silica. Diese initialen Vorläufer werden durch die Zugabe von Salzsäure neutralisiert, was die Gelbildung fortschreiten lässt und die Verkapselung von Bakterien in einem Silica-Netzwerk zur Folge hat (Nassif et al., 2003). Mit der Entdeckung von Silicatein, einem Enzym, das aus Demospongien isoliert wurde und die Bildung von poly(Silicat) katalysiert, wurde es möglich, poly(Silicat) unter physiologischen Bedingungen zu synthetisieren. Silicatein wurde rekombinant in E. coli hergestellt und ist in der Lage, bei Raumtemperatur, neutralem pH-Wert und in wässrigen Puffersystemen aus Siliziumalkoxiden poly(Silicat) zu bilden (Krasko et al., 2000; Müller et al., 2007b; Zhou et al., 1999). In vivo katalysiert Silicatein die Synthese der Silicathülle der Schwamm-Spiculae (Skelettelemente; Müller et al., 2005b; Müller et al., 2007a; Müller et al., 2007b; Schröder et al., 2007a). Dieses Biosilica wurde in Form von Silica-Nanospheren mit Durchmessern zwischen 100 nm und 250 nm organisiert vorgefunden (Pisera 2003; Tahir et al., 2005). Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Escherichia coli erfolgreich mit dem Silicatein-Gen transformiert werden kann. Das Level der Proteinexpression kann in Anwesenheit von Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) effizient erhöht werden, indem man die Bakterienzellen gleichzeitig mit Kieselsäure inkubiert. Dieser Effekt konnte sowohl auf Ebene der Synthese des rekombinanten Proteins durch Western Blot als auch durch Immunfluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden. Das heterolog produzierte Silicatein besitzt enzymatische Aktivität und kann die Polymerisation von Kieselsäure katalysieren. Dies konnte sowohl durch Färbung mit Rhodamin123, als auch durch Reaktion der nicht polymerisierten, freien Kieselsäure mit dem ß-Silicomolybdato-Farbsystem (Silicomolybdänblau) nachgewiesen werden. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass nur die silicateinexprimierenden Bakterien während des Wachstums in Anwesenheit von Kieselsäure eine viskose Hülle um Zelle herum bilden. Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass Silicatein-α aus Suberites domuncula nach Transformation in E. coli an die Zelloberfläche dieser Zellen transportiert wurde und dort seine enzymatische Funktion beibehielt. Die Silicathülle wurde mittels Raster- Elektronenmikroskopie (REM) analysiert. Die Bakterien, die Silicatein exprimierten und poly(Silicat) an ihrer Oberfläche synthetisierten, zeigten die gleichen Wachstumsraten wie die Bakterien, die das Gen nicht enthielten. Schlussfolgernd lässt sich sagen, dass die silicateinvermittelte Verkapselung von Bakterien mit poly(Silicat) die Bandbreite der Anwendung von Bakterien für die Produktion von rekombinanten Proteinen verbessern, erweitern und optimieren könnte.Bioencapsulation is a fascinating way to immobilize biological materials, including cells in silica, metal-oxides or hybrid sol-gel polymers. Until now only the sol-gel precursor technology was utilized to immobilize bacteria or yeast cells in silica. For this purpose different reagents were tested as aqueous precursors to create poly(silicate) on biomolecules (Bhatia et al., 2000) or cells (Liu and Chen, 1999; Coradin and Livage, 2007). One of the most successful methods so far is using a mixture of silicates and colloidal silica. These initial precursors are neutralized by the addition of hydrochloric acid to continue the progress of gelation, which results in the encapsulation of bacteria in a silica-network (Nassif et al., 2003). With the discovery of silicatein, an enzyme isolated from demosponges which catalyzes the formation of poly(silicate), it became possible to synthesize poly(silicate) under physiological (ambient) conditions. Silicatein was produced recombinant in E. coli and it is able to create poly(silica) from silicon alkoxides at room temperature, neutral pH and in aqueous buffer systems (Krasko et al., 2000; Müller et al., 2007b; Zhou et al., 1999). In vivo silicatein catalyzes the synthesis of the silica shell in sponge spiculae (sceletal elements; Müller et al., 2005b; Müller et al., 2007a; Müller et al., 2007b; Schröder et al., 2007a). This biosilica was found to be organized in nanospheres of diameters between 100 nm and 250 nm (Pisera 2003; Tahir et al., 2005). This work showed that Escherichia coli can be successfully transformed with the silicatein gene. The level of its protein expression in the presence of isopropyl β-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) can be efficiently increased by co-incubation of the bacteria with silicic acid. This effect could be demonstrated on the level of recombinant protein synthesis by Western Blot as well as by immunostaining analysis. The heterologously produced silicatein is enzymatically active and can catalyze the polymerization of silicic acid, as confirmed by staining with Rhodamine 123 and by reaction of non polymerized, free silicic acid with the ß-silicomolybdato color-system (silicomolybdenum-blue). Electron microscopic analysis revealed, that only the bacteria that express silicatein form a viscous layer around them when growing in the presence of silicic acid. It was also demonstrated, that silicatein-α from S. domuncula after transformation in E. coli is transported to the cell surface and maintained its enzymatic activity. The silica shell was analyzed by scanning electron microscopy (SEM). The silicatein expressing bacteria which synthesized poly(silicate) on their surface showed the same growth kinetics as the bacteria lacking this gene. It is concluded, that silicatein mediated encapsulation of bacteria with silica might improve, extend and optimize the range of application of bacteria for the production of recombinant proteins. r