Funktionelle Analyse der Meprin-Metalloproteasen alpha und beta hinsichtlich ihrer physiologischen Regulation und biologischen Bedeutung

Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, ein besseres Verständnis der beiden Metalloproteasen Meprin α und β in ihrem proteolytischen Netzwerk hinsichtlich ihrer physiologischen Regulation durch endogene Inhibitoren, wie auch der biologischen Funktion von Meprin α für den Prozess der Angiogenese, zu erlangen. rnMit der Analyse des ersten identifizierten endogenen Meprin-Inhibitors Fetuin-A gelang die Bestimmung der Ki-Werte für Meprin α mit 4,2 x 10-5 M und 1,1 x 10-6 M für Meprin β. Des Weiteren konnte für Meprin β eine Schnittstelle im Fetuin-A validiert werden. Mit der Identifizierung von Cystatin C, einem Cystein-Protease-Inhibitor als endogener Inhibitor der Metalloprotease Meprin α, mit einem Ki-Wert von 8,5 x 10-6 M, wurden erstmals Proteasefamilie-übergreifende Inhibitionsmechanismen für Metalloproteasen offenbart.rnDie Analyse von drei potentiellen Meprin-Inhibitoren, identifiziert als Substrate in einem neuen Proteomics-Analyse-Verfahren terminal amine isotopic labeling of substrates (TAILS), ermöglichte die Charakterisierung von Elafin als spezifischen Meprin α-Inhibitor. Für Elafin ist es außerdem gelungen, die durch TAILS ermittelte Schnittstelle für Meprin α mittels Edman Sequenzierung zu validieren. Der secretory leukocyte peptidase inhibitor (SLPI), ein Elafin-Homolog, konnte als weiteres Meprin α-Substrat bestätigt werden. Außerdem gelang es, die Meprin α-Schnittstelle im SLPI zu validieren.rnEin weiteres Ziel dieser Arbeit war, ein besseres Verständnis der biologischen Funktion der Metalloprotease Meprin α zu erlangen. Hier konnte in vivo eine stark pro-angiogene Wirkung von Meprin α gezeigt werden und erstmals die Expression von Meprin α, jedoch nicht von Meprin β, in Endothelzellen nachgewiesen werden. Zugleich konnte mit der Analyse der durch die TAILS-Methode identifizierten pro-angiogenen Substrate vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) und connective tissue growth factor (CTGF) der Regulationsmechanismus von Meprin α in der Angiogenese identifiziert werden. So ist Meprin α durch die Spaltung von CTGF in der Lage VEGF-A – gebunden und inhibiert im Komplex mit CTGF – durch proteolytische Spaltung von CTGF wieder freizusetzen. Somit wird die inhibierte VEGF-A-Aktivität wieder vollständig hergestellt. rnMit der Charakterisierung der ersten endogenen Meprin-Inhibitoren ist es gelungen, zu einem besseren Verständnis der endogenen Regulation der Meprine beizutragen und eine Proteasefamilie-übergreifende endogene Regulation aufzuzeigen. Mit der Entdeckung von Meprin α als pro-angiogene Protease und der Entschlüsselung des angiogenen Regulationsmechanismus konnte eine essentielle biologische Bedeutung dieser Protease beschrieben werden.rnIn this study, Fetuin-A was the first endogenous meprin inhibitor identified by meprin affinity chromatography in human blood plasma. Kinetic studies revealed a Ki of 4,2 x 10-5 M for meprin α and a Ki of 1,1 x 10-6 M for meprin β. For meprin β, a cleavage site could be validated by Edman sequencing. As far as could be identified, the fetuin-A related protein inhibitor, cystatin C, to be an endogenous inhibitor for meprin α but not for meprin β. The calculated Ki for meprin α by cystatin C was 8,5 x 10-6 M. For the first time we showed an overall family inhibition mechanism for meprins by identifying cystatins as their endogenous inhibitors. rnUsing a novel proteomics approach TAILS (terminal amino isotopic labelling of substrates) we found over 200 unknown meprin substrates. Three potential endogens meprin inhibitors were investigated, one of which elafin, was successfully validated as an inhibitor for meprin α. Furthermore we validated the cleavage site found by TAILS analysis with Edman sequencing. The secretory leucocyte inhibitor (SLPI), a elafin homologue, could also be validated as meprin α substrate, when a cleavage site for meprin α was validated by Edman sequencing. rnUnderstanding the physiological function of the metalloprotease meprin α was another aim in this thesis. Here we could demonstrate a strong pro-angiogenic effect for the human meprin α and could show that meprin α but not meprin β is expressed in endothelial cells. By analysing the pro-angiogenic targets of meprin α, identified by TAILS, we were able to determine the molecular interactions regulating angiogenesis. Vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) and connective tissue growth factor (CTGF) are proteolytically processed by meprin. Meprin α regulates angiogenesis by cleaving CTGF and thereby releasing extracellular bound and inhibited VEGF-A. Upon release, VEGF-A regains its full activity. rnThus, with the revealed existence of three novel endogenous meprin inhibitors, the endogenous regulation of the meprins was described for the first time, as well as an overall family inhibition mechanism. By revealing the physiological role of meprin α during angiogenic processes and describing the molecular interactionss an essential biological function of meprin α could be described. r