Untersuchungen zu Migration, Homing und Effektor-Funktionen humaner T-Lymphozyten in NOD.Cg-Prkdc scid Il2r gtm1Wjl, SzJ-Mäusen im Rahmen der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Die akute myeloische Leukämie (AML) zählt zu den aggressivsten neoplastischen Erkrankungenrnder Hämatopoese. Die Mehrheit der Patienten mit AML erreicht nach Induktions-rnChemotherapie den Zustand der kompletten Remission, jedoch erleiden mehr als die Hälfterndieser Patienten anschließend einen Rückfall und versterben an den Folgen der Erkrankungrn[1]. Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (engl.: hematopoietic stem cellrntransplantation, HSCT) stellt die einzig putativ kurative Behandlungsform für rezidierendernPatienten und solche mit schlechter Prognose dar. Jedoch birgt diese Form der Therapiernauch eine Vielzahl an Risiken. Insbesondere das Auftreten einer akuten Transplantat-gegen-rnWirt-Erkrankung (engl.: graft-versus-host disease, GvHD) stellt die Hauptursache für transplantationsassoziierternMortalität und Morbidität dar [2]. Die Depletion von alloreaktiven zytotoxischenrnT Lymphozyten (CTL) aus dem Transplantat ermöglicht zwar die Prävention derrnEntstehung einer GvH-Erkrankung, jedoch häufig unter gleichzeitigem Verlust des förderlichen,rnanti-leukämischen Transplantat-gegen-Leukämie-Effekts (engl.: graft-versus-leukemia,rnGvL) [3]. Um den GvL-Effekt unter Vermeidung einer GvH-Erkrankung zu erhalten, bietetrnsich der gezielte adoptive Transfer von Leukämie-spezifischen, nicht alloreaktiven CTL alsrnattraktive Strategie der Immuntherapie für AML-Patienten nach allogener HSCT an. In derrnvorliegenden Arbeit konnte erfolgreich ein prä-klinisches murines AML-Modell unter Einsatzrndes stark immundefizienten NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ- (NSG-) Mausstamms und primärenrnAML-Blasten durch die Optimierung bereits publizierter Protokolle etabliert werden.rnBei zehn von 17 transplantierten primären AML-Proben konnte ein erfolgreiches Engraftmentrnder humanen Zellen und eine Rekonstitution der humanen Neoplasie in den NSG- Mäusenrnerzielt werden. Die Engraftment-Rate betrug somit 58,82% und lag etwas unter dem aus derrnLiteratur bekannten Wert von 65-70% [4, 5]. Es ließen sich gut, intermediär und schlecht anwachsendernAML-Proben anhand der Engraftment-Stärke und -Reproduzierbarkeit voneinanderrnunterscheiden. Anhand der Analyse von für das Engraftment kritischer Parameter konnternein Zusammenhang zwischen Engraftment-Rate in der Maus und Flt3-Mutationsstatus sowiernFAB-Klassifikation des Patienten hergestellt und somit Angaben aus der Literatur bestätigtrnwerden. Für zwei Patienten-spezifische AML-Modelle, MZ580 und MZ308, konnten in vitrornerfolgreich AML-reaktive, über einzelne bzw. duale HLA-Diskrepanzen restringierte CTLPopulationenrngeneriert und über einen Zeitraum von bis zu 70 Tagen expandiert werden.rnDeren adoptiver Transfer in zuvor mit humanen AML-Blasten inokulierte NSG-Mäuse führternzu einer nahezu vollständigen Eradikation der AML-Blasten und Remission der Versuchstiere.rnAnhand unterschiedlich langer in vitro Kultur-Zeiträume konnte ein für die in vivo ausgeübtenrnEffektor-Funktionen optimaler Reifungszustand der CTL-Populationen von maximalrn28 Tagen bestimmt werden. Die kinetische Analyse der lytischen Aktivität in vivo deutete auf eine relativ schnelle Ausübung der Effektor-Funktionen durch die CTL-Populationen innerhalbrnvon zwei bis 24 Stunden nach adoptivem Transfer hin. Durch die Verwendung von inrnvitro generierten EBV-reaktiven CTL aus einem irrelevanten Spender konnte zudem die Spezifitätrnder in vivo ausgeübten Effektor-Funktionen nachgewiesen werden. Die ex vivo Re-rnIsolation adoptiv transferierter CTL und deren in vitro Analyse in einem IFNγ ELISpot wiesrneine konstante Reaktivität der Zellen ohne Induktion einer Xeno-Reaktivität nach. Die zurrnVerbesserung der Persistenz humaner CTL-Populationen eingesetzten autologen CD4+ TrnZellen zeigten nur im AML MZ308-System eine positive Wirkung. Generell konnte die Persistenzrnin vivo jedoch trotz initialer Substitution mit den Zytokinen IL-2 und IL-7 nicht über einenrnZeitraum von sieben Tagen hinaus aufrechterhalten werden.rnZur Untersuchung des Extravasations-Mechanismus humaner T Zellen über murines Endothelrnwurden sowohl Flusskammer- als auch Transwell-Studien durchgeführt, um die molekularenrnGrundlagen des Adhäsions- und Transmigrationsprozesses aufzuklären. Durch denrnparallelen Einsatz humaner und muriner T Zellen auf murinen Endothelzellen unter Zusatzrnfunktionsblockierender monoklonaler Antikörper konnte gezeigt werden, dass derrnExtravasations-Mechanismus beider Spezies auf Interaktionen homologer Adhäsionsmolekül-rnPaare, nämlich VLA-4–VCAM-1 und LFA-1–ICAM-1, beruht. Für einzelne Moleküle konntenrnin Abhängigkeit der eingesetzten Endothelzellen Unterschiede in der Funktionalität zwischenrnden Spezies identifiziert werden. Der Adhäsionsprozess war durch die Blockade derrnVLA-4–VCAM-1-Interaktion stärker inhibierbar als durch die Blockade von LFA-1–ICAM-1.rnDie Transmigration hingegen war durch die Blockade beider Adhäsionsmolekül-Paare vergleichbarrnstark inhibierbar.Acute myeloid leukemia (AML) is one of the most aggressive neoplastic, hematopoetic malignancies. Most patients suffering from AML reach complete remission after induction chemotherapy, however more than half of these patients die from relapse of the disease. Allogeneic hematopoetic stem cell transplantation (HSCT) is the only putative curative treatment for patients in relapse or with poor prognosis, still it is not riskless. In particular the occurrence of graft-versus-host disease (GvHD) is the main reason for transplantation-associated mortality and morbidity. The depletion of alloreactive cytotoxic T Lymphocytes (CTL) from the graft helps prevent the occurrence of GvHD, however it also leads to the loss of the beneficial anti-leukemic graft-versus- leukemia (GvL) effect. An attractive immunotherapeutic strategy for patients with AML after allogeneic HSCT is the selective adoptive transfer of leukemia-specific, non-alloreactive CTL in order to keep up the GvL effect while avoiding the development of a GvHD. In the present work we successfully established a preclinical murine AML-model using highly immunodeficient NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ- (NSG-) mice and primary AML blasts while optimising existing protocols. A successful engraftment of human cells and an associated reconstitution of the human neoplasia in NSG mice could be achieved in 10 out of 17 transplanted primary AML samples. The corresponding engraftment rate of 58,82% was slightly lower than published literature values of 65-70%. By means of analysis of engraftment strength and -reproducibility well, median and poor engrafting primary AML samples could be identified. A correlation between the engraftment capacity in mice and the presence of Flt3 mutations as well as the patient’s FAB classification was identified by the analysis of parameters which are critical for potential engraftment. These results confirmed published literature values. For two patient-specific AML-models, MZ580 and MZ308, we were able to generate and expand single/dual HLA-mismatch-restricted, AML-reacitve CTL populations in vitro over up to 70 days. Adoptive transfer of these CTL populations into NSG mice prior inoculated with human AML blasts led to a nearly complete eradication of the AML blasts and a remission of the animals. We could identify an ideal in vitro culture period of approximately 28 days to generate CTL populations with highly efficient effector functions in vivo. A kinetic analysis of the CTL’s lytic activity in vivo indicated a relatively fast exertion of effector functions within two to 24 hours post adoptive transfer. The use of in vitro generated EBV-B cell reactive CTL from an irrelevant third party donor demonstrated the specificity of the exerted effector functions in vivo. An ex-vivo reisolation of adoptively transferred CTL and their analysis in vitro using IFNγ ELISpot analysis showed a constant reacticity of the cells without induction of xenoreactivity. The use of autologous CD4+ T cells led to improved persistence of human CTL only in the AML MZ308 system. In general, the persistence of CTL populations in vivo could not be maintained longer than seven days, in spite of initial substitution with human cytokines IL-2 and IL-7.rnIn order to decipher the molecular mechanisms of adhesion and transmigration of human T cells during extravasation over murine endothelium, both flow chamber and transwell assays were performed. The parallel use of human and murine T cells on murine endothelial cells in flow chambers led to the discovery that by adding function-blocking monoclonal antibodies, in both species the same interactions of homologous adhesion molecules (VLA-4–VCAM-1 and LFA-1–ICAM-1) is blocked and thus relevant for the mechanism of extravasation. Depending on the type of endothelial cells used, differences in functionality between species could be identified for single molecules. Adhesion could be inhibited more vigorously by blocking the VLA-4–VCAM-1 interaction than by blocking the LFA-1–ICAM-1 interaction. Transmigration, however, could be inhibited nearly equally by blocking each interaction