Komparative Analyse der humanen Chromosomenregion 11p15.3 um die Gene LMO1,TUB und der orthologen Region in der Maus

Ziel der vorliegenden Arbeit war die vergleichende Sequenzierung und nachfolgende Analyse des syntänen chromosomalen Abschnitts auf dem kurzen Arm des humanen Chromosoms 11 in der Region 11p15.3 mit den Genen LMO1, TUB und dem orthologen Genomabschnitt der Maus auf Chromosom 7 F2. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Kartierung dieser beiden chromosomalen Bereiche ermöglichte die Komplettierung einer genomischen Karte auf insgesamt über eine Megabase, die im Kooperationssequenzierprojekt der Universitäts-Kinderklinik und dem Institut für Molekulargenetik in Mainz erstellt wurde. Mit Hilfe von 28 PAC- und Cosmid-Klonen konnten in dieser Arbeit 383 kb an genomischer DNA des Menschen und mit sechs BAC- und PAC-Klonen 412 kb an genomischer DNA der Maus dargestellt werden. Dies ermöglichte erstmals die exakte Festlegung der Reihenfolge der in diesem chromosomalen Abschnitt enthaltenen Gene und die genaue Kartierung von acht STS-Markern des Menschen, bzw. vier STS-Sonden der Maus. Es zeigte sich dabei, dass die chromosomale Orientierung telomer-/centromerwärts des orthologen Bereichs in der Maus im Vergleich zum Menschen in invertierter Ausrichtung vorliegt. Die Sequenzierung von drei humanen Klonen ermöglichte die Bestimmung von 319.119 bp an zusammenhängender genomischer DNA. Dadurch konnte die genaue Lokalisation und Strukturaufklärung der Gene LMO1, ein putatives Tumorsuppressorgen, das mit der Entstehung von Leukämien assoziiert ist, und TUB, ein Transkriptionsmodulator, der in die Fettstoffwechselregulation involviert ist, vorgenommen werden. Für das murine Genom wurden 412.827 bp an neuer DNA-Sequenz durch Sequenzierung von ebenfalls drei Klonen generiert. Der im Vergleich zum Menschen ca. 100 kb größere Genombereich beinhaltete zudem die neuen Gene Stk33 und Eif3. Es handelte sich dabei um zwei Gene, die erst im Rahmen dieser Arbeit entdeckt und charakterisiert wurden. Die parallele Bearbeitung beider Genombereiche ermöglichte eine umfassende komparative Analyse nach kodierenden, funktionellen und strukturgebenden Sequenzabschnitten in beiden Spezies. Es konnten dabei für beide Organismen die Exon-Intron-Strukturen der Gene LMO1/Lmo1 und TUB/Tub geklärt. Zudem konnten vier neue Exons und zwei neue speziesspezifischer Spleißvarianten für TUB/Tub beschrieben werden. Die Identifizierung dieser neuen Spleißvarianten offenbart neue Möglichkeiten für alternative Regulation und Funktion, oder für eine veränderte Proteinstruktur, die weitere Erklärungsansätze für die Entstehung der mit diesen Genen assoziierten Erkrankungen zulässt. In der sequenzierten, größeren Genomsequenz der Maus konnte in den flankierenden, nicht mit der sequenzierten Humansequenz überlappenden Bereich das neue Gen Eif3 in seiner Exon-Intron-Struktur und die beiden letzten Exons 11 und 12 des Gens Stk33 kartiert und charakterisiert werden. Die umfangreiche Sequenzanalyse beider sequenzierter Genombereiche ergab für den Abschnitt des Menschen insgesamt 229 potentielle Exonsequenzen und für den Bereich der Maus 527 mögliche Exonbereiche. Davon konnten beim Menschen explizit 21 Exons und bei der Maus 31 Exons als exprimierte Bereiche identifiziert und experimentell mittels RT-PCR, bzw. durch cDNA-Sequenzierung verifiziert werden. Diese Abschnitte beschrieben nicht nur die Exonbereiche der oben genannten vier Gene, sondern konnten auch neuen nicht weiter definierten EST-Sequenzen zugeordnet werden. Mittels des Interspeziesvergleiches war darüber hinaus auch die Analyse der nichtkodierenden Intergen-Bereiche möglich. So konnten beispielsweise im ersten Intron des LMO1/Lmo1 sieben Sequenzbereiche mit Konservierungen von ca. 90% bestimmt werden. Auch die Charakterisierung von Promotor- und putativ regulatorischen Sequenzabschnitten konnte mit Hilfe unterschiedlicher bioinformatischer Analyse-Tools durchgeführt werden. Die konservierten Sequenzbereiche der DNA zeigen im Durchschnitt eine Homologie von mehr als 65% auf. Auch die Betrachtung der Genomorganisation zeigte Gemeinsamkeiten, die sich meist nur in ihrer graduellen Ausprägung unterschieden. So weist ein knapp 80 kb großer Bereich proximal zum humanen TUB-Gen einen deutlich erhöhten AT-Gehalt auf, der ebenso im murinen Genom nur in verkürzter Version und schwächer ausgeprägt in Erscheinung tritt. Die zusätzliche Vergleichsanalyse mit einer weiteren Spezies, den orthologen Genomabschnitten von Fugu, zeigte, dass es sich bei den untersuchten Genen LMO1 und TUB um sehr konservierte und evolutiv alte Gene handelt, deren genomisches Organisationsmuster sich auch bei den paralogen Genfamilienmitglieder innerhalb derselben Spezies wiederfindet. Insgesamt konnte durch die Kartierung, Sequenzierung und Analyse eine umfassende Datenbasis für die betrachtete Genomregion und die beschriebenen Gene generiert werden, die für zukünftige Untersuchungen und Fragestellungen wertvolle Informationen bereithält.The aim of the presented work was the comparative sequencing and the following analysis of the synteny in the chromosomal DNA of the short arm of human chromosome 11 in the sub region 11p15.3 which harbors the genes LMO1, TUB and the orthologue genome region in mice on chromosome 7 F2. Within this dissertation the mapping of both chromosomal regions allowed to expand a genomic map to more than one mega base in total, which was built in the sequencing project of the Department of Pediatrics and the Institute of Molecular Genetics of the University of Mainz. With the aid of 28 PAC and cosmid clones this work shows 383 kilobase of genomic DNA in human and with 6 BAC and PAC clones a distance of 412 kilo base of genomic DNA in mouse. For the first time these results allowed the exact ordering of all genes in this chromosomal region and the accurate mapping of 8 STS-marker in human and 4 STS-Probes in mouse respectively. Furthermore, the outcome showed that the chromosomal orientation focusing telomere and centromer of the orthologouse region in mouse was compared to human chromosoms inverted. The sequencing of three human clones allowed the identification of 319,119 base pairs of genomic DNA without interruption. This enabled the exact localization and characterization of the structure of the genes LMO1, a putative tumor suppressor gene, which is associated with the onset of leukemia. and the TUB gene, a modulator of transcription that is involved in the regulation of the fat metabolism. Sequencing of 3 murine DNA clones a 412,827 base pair DNA region of new sequence information. In comparison to the human genome the mouse sequence covers a 100 kilo base larger DNA region including two new genes stk33 and eif3. Those two genes were unknown before and were discovered and characterized for the first time in this work. The simultaneous processing of both genome regions enabled a wide comparative analysis of coding, functional and structural important sequence stretches in both species. This way the exon/intron structures of the genes LMO1/lmo1 and TUB/tub were determined in both species. Moreover four new exons and two splicing variants of the TUB/tub gene could be described. The identification of these new splicing variants opens novel possibilities for alternative regulations and functions, or for an altered protein structure, which in turn allows further explanatory approaches for the onset of diseases associated with these genes.rnIn the here sequenced mouse sequences, that are larger and a non-overlapping part with the human sequences, we mapped and characterised the new Eif3 gene with its exon–intron structure and the last exons 11 and 12 of the mouse gene Stk33. The results of the broad sequence analysis of both sequenced genome areas showed overall 229 potential exon sequences for the human part and 527 putative exon sequences in mouse. Of those 21 human exons and 31 murine exons have been identified by expressionanalysis via RT-PCR or respectively by cDNA sequencing. These sequences were not only mapping to the exon areas of the four genes named above, but could also get assigned to new EST sequences which have not been characterized yet. By interspecies comparative approaches it was possible to analyse also non-coding intergenic areas. By this aproach it was possible to identify in the first exon of LMO!/lmo1 seven higly conserved sequence stretches with homologies of approximately 90%. Additionally promotor and putative regulatory sequence sections even have been characterized with the aid of different bioinformatical analysis tools. The conserved DNA element show a homology of more than 65% in average over the sequences. Even the examination of the genome organization demonstrated similarities that just differed in the gradual manner. For example, within the almost 80 kb DNA section which that is located proximal to the human TUB gene a significant higher level of AT-nucleotides wa observed, that appears also in the murine genome but is reduced in length. The additional comparative analysis with another species – in this case the orthologue genome sequence of Fugu – showed that the genes LMO1 and TUB are highly conserved and evolutive ancient genes, whose genomic organisation pattern of organization is found also in the paralogue genefamily members within the same species. Overall, mapping, sequencing and analysis generated a comprehensive data set being a broad basis for further analysis of the examined genome region and the here described genes, that gives valuable information for future investigations and questions