Clostridium difficile: Entdeckung und Charakterisierung der autokatalytischen Prozessierung von Toxin B

Clostridium difficile, der Auslöser der nosokomialen Antibiotika-assoziierten Durchfälle und der Pseudomembranösen Kolitis, besitzt zwei Hauptvirulenzfaktoren: die Toxine A und B. In vorangegangenen Veröffentlichungen wurde gezeigt, dass Toxin B durch einen zytosolischen Faktor der eukaryotischen Zielzelle während des Aufnahmeweges in die Zelle gespalten wird. Nur die N-terminale katalytische Domäne erreicht das Zytosol. Hierbei wurde davon ausgegangen, dass eine Protease der Zielzelle die Spaltung katalysiert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Spaltung von Toxin B ein intramolekularer Prozess ist, der zytosolisches Inositolphosphat der Zielzelle als Kofaktor zur Aktivierung der intrinsischen Protease benötigt. Die Freisetzung der katalytischen Domäne durch Inositolphosphat- induzierte Spaltung ist nicht nur das Prinzip des Clostridium difficile Toxin B sondern auch des Toxin A, als auch des alpha Toxin von Clostridium novyi und das Letale Toxin von Clostridium sordellii. Der kovalente Inhibitor von Aspartatproteasen 1,2-epoxy-3-(p-nitrophenoxy)propan (EPNP), wurde dazu verwendet die intrinsische Protease von Toxin B zu blockieren und ermöglichte die Identifikation des katalytischen Zentrums. EPNP modifiziertes Toxin B verliert die intrinsische Proteaseaktivität und Zytotoxizität, aber wenn es direkt in das Zytosol der Wirtszelle injiziert ist, bleibt die Toxizität erhalten. Diese ist damit der erste Bericht eines bakteriellen Toxins, das eukaryotische Signale zur induzierten Autoproteolyse nutzt, um seine katalytisch-toxische Domäne in das Zytosol der Zielzelle freizusetzen. Durch diese Ergebnisse kann das Modell der Toxin-Prozessierung nun um einen weiteren entscheidenden Schritt vervollständigt werden.Clostridium difficile, the causative agent of antibiotic-associated diarrhea and pseudomembranous colitis, is a major nosocomial germ in many health care institutions throughout the world. The main virulence factors are two large protein cytotoxins, toxin A (TcdA) and toxin B (TcdB). It was proposed earlier that TcdB is cleaved by a cytosolic factor of the eukaryotic target cell during its cellular uptake, with solely the N-terminal catalytic domain reaching the cytosol. This work shows that cleavage of TcdB is an intramolecular process and that host cytosolic inositolphosphates act as cofactors for protease activation. The results of this work show that the addition of inositol hexaphosphate activates the latent protease function not only in TcdB but also TcdA, Tcnα and TcsL, from C. difficile, C. novyi and C. sordellii. 1,2-epoxy-3-(p-nitrophenoxy)propane (EPNP), a covalent inhibitor of aspartate proteases, was used to block the intrinsic aspartate protease function and allowed the identification of the catalytically active site of TcdB. The EPNP-derivative of TcdB does not show autocatalytical activation and loses cellular toxicity, but remains toxic when directly injected into the cytosol. This is the first report on a bacterial toxin that uses eukaryotic signals for induced autoproteolysis to deliver its toxic domain into the cytosol of target cells. Based on these data, an integrated model for the uptake and intracellular inositolphosphate-induced activation of TcdB can be presented