Einfluss von oxidativem Stress auf die DNA-Reparatur in Säugerzellen

Gegenstand dieser Arbeit war es, das Zusammenspiel zwischen DNA-Reparatur und zellulärem anitoxidativen Abwehrsystem in Melanomzellen und gesunden Hautfibroblasten näher zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die dominierenden DNA-Läsionen im Falle einer Bestrahlung mit sichtbarem Licht (400 – 800 nm) Fpg-sensitive Läsionen, zu denen die Basenmodifikation 7,8-Dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG) gehört, und im Falle der UVA-Bestrahlung Cyclobutan-Pyrimidindimere (CPDs) sind. Sowohl Melanomzellen als auch Hautfibroblasten waren problemlos in der Lage, die durch sichtbares Licht und UVA-Strahlung induzierten oxidativen DNA-Modifikationen zu reparieren. Jedoch reagierten Melanomzellen in einer adaptiven Antwort mit einer Erhöhung ihres Glutathion-Gehalts auf ein Maximum (nach circa 10 - 14 h) nach Bestrahlung mit sichtbarem Licht, wohingegen die Hautfibroblasten einen massiven Einbruch direkt nach Bestrahlung und eine extrem lange Erholungsphase über 48 h aufzuweisen hatten. Die darauffolgende Untersuchung der DNA-Reparaturkapazität der Zellen unter Bedingungen von oxidativem Stress mit vorangegangener Depletion intrazellulären Glutathions zeigten eine dramatische, nahezu vollständige Hemmung der Reparatur durch UVA- bzw. Sonnenlicht-induzierter Fpg-sensitiver DNA-Modifikationen (8-oxoG) - sowohl in Melanomzellen als auch in Hautfibroblasten. Dieser Effekt ließ sich durch den Zusatz von Dithiothreitol (DTT), nach erfolgter Bestrahlung der Glutathion-depletierten Zellen, wieder komplett revertieren. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass an der Reparatur ein redoxempfindliches Protein oder zellulärer Cofaktor beteiligt sein muß. Zudem konnte durch Untersuchungen der Nukleotidexzisionsreparatur (NER) und der Einzelstrangbruchreparatur nach dem gleichen Versuchsdesign gezeigt werden, dass es sich hierbei sehr wahrscheinlich um einen für die Basenexzisionsreparatur (BER) von 7,8-dihydro-8-oxo-guanine (8-oxoG) exklusiven Effekt handelte. Zwei der wichtigsten Reparaturproteine der BER, nämlich hOGG1 und APE1, wurden anschließend auf ihre Funktionsfähigkeit hin untersucht, da es naheliegend war, dass der Reparaturhemmung ein Funktionsverlust eines dieser beiden Enzyme zugrunde liegen könnte. Im Falle des APE1-Proteins konnte dies ausgeschlossen werden, da mit Hilfe der Alkalischen Elution die volle Funktionsfähigkeit für die Reparatur von AP- Läsionen nachgewiesen werden konnte. Interessanterweise zeigte aber das hOGG1-Protein eine zwischen der dritten und vierten Stunde nach Bestrahlung Glutathion-depletierter Zellen stark abfallende Aktivität der 8-oxoG-Glykosylasefunktion. Die Western-Blot-Analyse ergab allerdings keinen Hinweis auf eine Proteinoxidation von hOGG1. Möglicherweise wird nicht hOGG1 selbst, wohl aber ein anderes, für eine konzertierte Abfolge der einzelnen Reparaturschritte entscheidend notwendiges Protein innerhalb der Zelle durch ROS leicht oxidiert. In jedem Fall bleibt festzustellen, dass Glutathion eine wichtige Aufgabe hinsichtlich einer voll funktionsfähigen Basenexzisionreparatur zuzukommen scheint. Die Ergebnisse unterstreichen die mögliche Bedeutung von oxidativem Stress für die Entstehung von Krebs durch Sonnenlicht, insbesondere durch UVA, da die durch die Strahlung (und eventuell auftretende Entzündung) gebildeten ROS nicht nur DNA-Schäden induzieren, sondern auch ihre Reparatur verhindern können.Aim of this work was to investigate the interaction of DNA-repair mechanisms and the antioxidative defense system of malignant melanoma cells and their corresponding healthy skin fibroblasts. The results clearly indicated that irradiation with visible light (400 – 800 nm) induces Fpg-sensitive lesions (mainly 7,8-dihydro-8-oxoguanine) and in case of irradiation with UVA, pyrimidine dimers (CPD). Both Melanoma cells and skin fibroblasts were able to repair the oxidative bases induced by visible light and UVA. However melanoma cells increased their cellular glutathione level in an adaptive answer and reached a maximum after 10 - 14 hours after irradiation with visible light, whereas skin fibroblasts showed a strong decrease and an extremely long recovery phase over 48 h. The subsequent experiments with preceding depletion of glutathione and irradiation with visible light or UVA showed a nearly complete and very dramatically reduction of the repair rate of oxidative DNA-lesions in both melanoma cells and skin fibroblasts. This effect was completely reversible after adding dithiothreitole (DTT) to the medium during repair time, indicating the involvement of a redox sensitive protein or cofactor in the repair of oxidative DNA-lesions. Furthermore additional results obtained with the same set of experiments clearly indicated that neither nucleotide-excision repair nor single-strand-repair but highly presumably only base-excision repair (BER) was exclusively retarded after glutathione depletion. Hereupon the examination focused on two of the most important proteins of the BER, namely hOGG1 and APE1, because of their possible involvement in the discovered repair retardation. In case of APE1 it showed normal function in the repair of AP-lesions after glutathione depletion with following irradiation with VIS. But in case of hOGG1 the function of its 8-oxoG-glykosylase activity decreased between 3 and 4 hours. Western blot analysis revealed no direct evidence for a strong protein oxidation or degradation of the hOGG1 protein. Possibly not hOGG1 but another for the concerted sequence of BER very important protein is being oxidised by the cellular reactive oxidative species (ROS) induced during irradiation with visible light. In any case we conclude that glutathione has an important function to maintain a functional base-excision repair. The obtained results emphasize a possible impact of oxidative stress to the induction of cancer caused by sun light, especially by UVA. The possibility was given that after irradiation induced ROS do not only damage cellular DNA but also can cause a retardation of DNA-repair