Conditional and transgenic mouse models as tools to study the role of TGFbeta, BMP signaling in skeletal development

Die TGFbeta/BMP Signaltransduktionskaskade ist wichtig für viele Entwicklungsprozesse fast aller embryonaler sowie extraembryonaler Gewebe und sie ist ebenso essentiell bei der Aufrechterhaltung der Homöostase im adulten Organismus. In vielen Mausmodellen und Zellkulturversuchen wurde gezeigt, dass Liganden dieses Signalweges in verschiedene Stadien der Knorpel- und Knochenentwicklung involviert sind. BMPs sind beispielsweise maßgeblich an der frühen Kondensation und Bildung des Knorpels und später an Proliferation und Hypertrophie der Chondrozyten beteiligt. BMPs können ektopisch Knochenbildung auslösen und das Expressionsmuster der Liganden und spezifischen Rezeptoren in der Wachstumsfuge lässt auf eine wichtige Rolle der BMPs in der Wachstumsfuge schließen. Der gezielte knock out der BMP-Rezeptoren Bmpr1a und Bmpr1b in proliferierenden Chondrozyten führt zur Ausbildung einer generellen Chondrodysplasie. Smad1, Smad5 und Smad8 sind die Mediatoren der BMP-Signalkaskade. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle und Funktion der Smad1- und Smad5-Proteine in der Wachstumsfuge untersucht werden. Hierzu wurden konditionale Smad1-knock out-Mäuse mit einer transgenen Mauslinie gekreuzt, die die Cre-Rekombinase spezifisch in proliferierenden Chondrozyten exprimiert. Diese Mäuse wurden mit und ohne heterozygotem Smad5-Hintergrund charakterisiert. Bei einem knock out von Smad1 allein konnte ein leichte Verkürzung der Wachstumsfuge beobachtet werden, wobei prähypertrophe und hypertrophe Zone gleichermaßen betroffen waren. Dieser Phänotyp war verstärkt in Mäusen mit zusätzlichem heterozygotem Smad5-Hintergrund. Eine Verringerung der Proliferationsrate konnte zusammen mit einer verminderten Ihh-Expression nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte anhand von Röntgenaufnahmen eine Dysorganisation der nasalen Region und ein fehlendes nasales Septum beobachtet werden. Produktion und Mineralisation der extrazellulären Matrix waren nicht beeinträchtigt. Um die Rolle der BMP- und TGFbeta-Signalkaskaden während der endochondralen Ossifikation zu vergleichen, wurden transgene Mäuse generiert, in denen die TGFbeta-Signalkaskade spezifisch in proliferierenden Chondrozyten gestört war. Zwei Mauslinien, die ähnliche Phänotypen zeigten, wurden untersucht. Esl1 ist ein TGFbeta-bindendes Protein, von dem man annimmt, dass es die TGFbeta-Signalkaskade inhibieren kann. Esl1-knock out-Mäuse sind kleiner als Wildtypmäuse und die Überexpression von Esl1 in proliferierenden Chondrozyten führt zu einer Verlängerung der Wachstumsfuge und einer verstärkten Proliferationsrate. Knorpelmarker, wie Col2a1 und Sox9 sind in diesen Mäusen herunterreguliert, während Col10a1 und Ihh als Marker für die hypertrophe und prähypertrophe Zone herunterreguliert waren. Dies führt zu der Annahme, dass mehr Zellen in die terminale Differenzierung eintreten. Bei transgenen Mäusen, in denen ein dominant-negativer (dn) TGFbeta-Rezeptor in proliferierenden Chondrozyten überexprimiert wurde, konnte eine verlängerte prähypertrophe Zone, eine erhöhte Ihh-Expression, sowie eine verstärkte Proliferationsrate beobachtet werden. Zusätzlich konnte in homozygoten Tieren ein craniofacialer Phänotyp beschrieben werden, der zu Problemen bei der Nahrungsaufnahme und damit zu einer starken Wachstumsbeeinträchtigung führte. Die BMP- und TGFbeta-Signalkaskaden haben möglicherweise antagonistische Effekte in der Wachstumsfuge. Während der Ausfall von BMP in proliferierenden Chondrozyten aufgrund einer gesunkenen Proliferationsrate zu einer Verkürzung der Wachstumsfuge führte, kann man in Mäusen mit einer Störung der TGFbeta-Signalkaskade eine verstärkte Proliferation in einer daher verlängerten Wachstumsfuge beobachten. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Generation einer transgenen Mauslinie, die die Cre-Rekombinase spezifisch in hypertrophen Chondrozyten exprimiert. Promoterstudien mit transgenen Mäusen weisen darauf hin, dass ein putatives AP1-Element, etwa 4 kb vor dem ersten Exon des Col10a1 gelegen, wichtig für die spezifische Expression in hypertrophen Chondrozyten ist. Ein Konstrukt, dass vier Kopien dieses Elements und den basalen Promoter enthält, wurde benutzt, um die Cre-Rekombinase spezifisch zu exprimieren. Diese Mauslinie befindet sich in der Testphase und erste Daten deuten auf eine spezifische Expression der Cre-Rekombinase in hypertrophen Chondrozyten hin.TGFbeta/BMP signaling is essential for normal developmental processes in almost all embryonic and extraembryonic tissues and it is also necessary for maintenance of homeostasis in adults. Ligands of this pathway are involved in the development of cartilage and bone at different stages. BMPs are important during early condensation of cartilaginous anlagen, proliferation and hypertrophy of chondrocytes. BMPs are able to induce ectopic bone development and the expression pattern of BMPs and their receptors in the growth plate suggest an important role of BMPs in this region. Knockout and conditional knockout mice of Bmpr1a and Bmpr1b developed a generalized chondrodysplasia. Smad1, Smad5 and Smad8 are mediators for the BMP signaling pathway. Since Smad1 and Smad5 are both expressed in the growth plate, the question arose, whether both have similar functions and if they could compensate the loss of one of the proteins. Therefore, to test this hypothesis, conditional Smad1 knockout mice were crossed with transgenic mice that express Cre recombinase specifically in proliferating chondrocytes with and without a heterozygous Smad5 background. Mice lacking Smad1 specifically in proliferating chondrocytes show only a slight shortening of the growth plate, while mice with an additional Smad5 heterozygous background show a more severe phenotype with shorter prehypertrophic and hypertrophic zones and exhibit a diminished proliferation rate. Ihh expression in these mice is downregulated. Additionally, X-ray analysis revealed a disorganized snout region with an absence of the nasal septum. Both, mineralization and the extracellular matrix production were not seen to be affected. In order to compare BMP and TGFbeta signaling during endochondral ossification, mice with a disrupted TGFbeta signaling in proliferating chondrocytes were generated as well. Two different transgenic mouse models were studied and showed similar phenotypes. Esl-1 is a TGFbeta binding protein, which is reported to inhibit TGFbeta signaling. Esl-1 null mice have been demonstrated to be smaller compared to their wild type littermates and overexpression of Esl-1 specifically in proliferating chondrocytes results in a longer growth plate and an enhanced proliferation rate. Cartilaginous markers like Col2a1 and Sox9 were shown to be downregulated while Col10a1 and Ihh as marker for prehypertrophic and hypertrophic chondrocytes were upregulated, suggesting that more cells enter chondrocyte hypertrophy. Mice that overexpress a dominant negative (dn) TGFbeta receptor I in proliferating chondrocytes showed an elongated growth plate with enhanced Ihh expression and an increased proliferation rate. Separate from the phenotype in the growth plate in dnTbetaRI transgenic mice, alterations were detected in the head of this mouse model, which led to a decreased size of homozygous mice, however most likely due to feeding problems. It appears that in the development of the long bones and especially in the proliferating zone of their growth plates, that signaling via the BMP and TGFbeta pathways has antagonistic effects. While disruption of BMP signaling leads to a shortening of the growth plate with fewer proliferating cells, impairment of TGFbeta signaling results in an increase in the proliferation rate and thus a longer prehypertrophic and hypertrophic zone. The second aim of this work was to generate mice that express Cre recombinase specifically in hypertrophic chondrocytes. Col10a1 is a marker specific for hypertrophic chondrocytes. Extensive promoter studies have been performed during the course of this thesis. A 300 bp putative AP1 element approximately 4 kb upstream of the first exon has been shown to drive specific lacZ expression in transgenic animals. A construct was generated that contains four copies of this element together with the basal Col10a1 promoter to drive specific Cre recombinase expression in hypertrophic chondrocytes. Final experiments are forthcoming, but preliminary data suggests that a mouse line will indeed be generated exhibiting strong and specific expression of Cre recombinase only in hypertrophic chondrocytes