Identifizierung von T-Zell-erkannten Nierenzellkarzinom-Antigenen

Eine Voraussetzung für die Entwicklung neuer immunmodulatorischer Therapieverfahren ist die Kenntnis immunogener Tumorantigene, die von tumorreaktiven T-Zellen erkannt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden tumorreaktive CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTL, cytotoxic T-lymphocytes) aus dem Blut eines HLA (human leukocyte antigen)-kompatiblen Fremdspenders generiert. Methodisch wurden hierzu CD8-selektionierte periphere Blutlymphozyten repetitiv mit der klarzelligen Nierenzellkarzinomlinie MZ1851-RCC (RCC, renal cell carcinoma) in einer allogenen gemischten Lymphozyten-Tumorzell Kultur (MLTC, mixed lymphocyte tumor cell culture) stimuliert. Aus den Responderlymphozyten wurden mit Hilfe des Grenzverdünnungsverfahrens klonale zytotoxische T-Zellen generiert und expandiert. Die CTL-Klone wurden anschließend phänotypisch mittels Durchflußzytometrie sowie funktionell mittels HLA-Antikörper-Blockadeexperimenten und Kreuzreaktivitätstests detailliert charakterisiert. Dabei konnte gezeigt werden, daß aus dem Blut eines allogenen gesunden Spenders CD8+ T-Zellen isoliert werden können, welche Reaktivität gegen Nierenzellkarzinome (NZK) aufweisen und über verschiedene HLA-Klasse-I-Allele restringiert sind. Die von den einzelnen CTL-Klonen erkannten Zielstrukturen zeigten entweder ubiquitäre (z.B. HLA-Cw*0704-reaktiver CTL-Klon E77) oder eine tumorspezifische (z.B. HLA-B*0702-restringierter CTL-Klon A4) Gewebeexpression. Zur Identifizierung der natürlich prozessierten Peptidliganden wurden die HLA-B/C-Allele unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers B123.2 aus einem zuvor hergestellten Detergenslysat der Nierenzellkarzinomlinie MZ1851-RCC immunchromatographisch aufgereinigt. Aus den so isolierten HLA-Peptid-Komplexen wurden die tumorassoziierten Peptidliganden nach Säureeluation und Filtration abgespalten und über eine „reverse phase“-HPLC (high performance liquid chromatography) fraktioniert. Die Überprüfung der einzelnen HPLC-Fraktionen auf Bioaktivität erfolgte mit den korrespondierenden CTL-Klonen in 51Cr-Zytotoxizitätstests. Dabei wurde eine HPLC-Fraktion identifiziert, die die lytische Funktion des HLA-B*0702-restringierten CTL-Klons A4 auslösen konnte. Die bioaktive HPLC-Fraktion wurde dazu durch eine zweite (second dimension) Kapillar-Flüssigkeitschromatographie (Cap-LC, capillar liquid chromatography) in Subfraktionen geringerer Komplexität aufgetrennt und die darin enthaltenen Peptidepitope durch das MALDI-TOF/TOF (matrix assisted laser desorption/ionization- time of flight/time of flight)-Analyseverfahren sequenziert. Innerhalb dieser HPLC-Fraktion wurden eine Vielzahl von HLA-B/C-assoziierten Peptidliganden erfolgreich sequenziert, was die Effektivität dieser Verfahrenstechnik zur Identifizierung natürlich prozessierter HLA-Klasse-I-bindender Peptide unter Beweis stellt. Leider war es mit dieser Methode bisher nicht möglich, das von CTL-Klon A4 detektierte Peptidepitop zu sequenzieren. Dies liegt möglicherweise in der unzureichenden Konzentration des Peptidepitops in der bioaktiven HPLC-Fraktion begründet. In Folgearbeiten soll nun mit erhöhter Probenmenge beziehungsweise verbesserter Analytik der erneute Versuch unternommen werden, das Zielantigen des CTL-Klons A4 zu identifizieren. Die Kenntnis von Antigenen, die tumorspezifisch exprimiert und von CD8+ CTL aus gesunden Spendern erkannt werden, eröffnet neue therapeutische Möglichkeiten, das spezifische Immunsystem des Stammzellspenders nach allogener Blutstammzelltransplantation gezielt zur Steigerung von Tumorabstoßungsreaktionen (z.B. durch Vakzinierung oder adoptivem T-Zelltransfer) zu nutzen.One premise for the development of new immunotherapies is the knowledge of tumor antigens recognized by tumor reactive T cells. CD8+ T lymphocytes derived from the blood of healthy individuals were stimulated against the renal cell carcinoma (RCC) MZ1851-RCC in an allogeneic mixed lymphocyte/tumor-cell culture (MLTC). MLTC responders were cloned by limiting dilution and monoclonal cytotoxic T lymphocytes (CTL) were generated and expanded. The CTL clones were characterized phenotypically by flow-cytometric analysis and functionally by HLA antibody-blocking tests and cross-reactivity experiments in detail. We show that from the blood of an allogeneic healthy donor CD8+ T cells could be isolated which responded to RCC and were restricted by various HLA-class-I alleles. The CTL clones recognized antigens with ubiquitous tissue expression (e.g. CTL clone E77) or tumor specific expression (e.g. CTL clone A4). Naturally processed peptides were acid-eluted from HLA-B/C molecules purified from 1.2x10E+10 MZ1851-RCC cells using anti-HLA-B/C mAb B123.2. Peptide ligands were fractionated on a reverse-phase (RP) high-performance liquid chromatography (HPLC) and aliquots of all HPLC fractions containing natural HLA-B/C-associated peptides were screened with corresponding CTL clones in 51Cr- release assays. One HPLC fraction was positively identified with the HLA-B*0702 restricted CTL clone A4. Using capillary liquid chromatography (Cap-LC) and MALDI-TOF/TOF (matrix-assisted laser-desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight) mass spectroscopy, we identified numerous HLA-B/C-associated naturally processed peptide ligands; showing the efficiency of this technique. The CTL A4-defined and HLA-B*0702-associated antigen could not be identified maybe due to insufficient sample quantity of the antigen in the positively tested HPLC fraction. One aim for the future is the identification of this CTL-defined antigen after the immune-chromatographic purification of HLA-B/C-associated peptides derived from more than 1.2x10E+10 MZ1851-RCC cells. The knowledge of antigens with tumor-specific expression recognized by CD8+ CTLs derived from an allogeneic healthy donor could lead to the establishment of new, specific immunotherapies to increase tumor regressions after hematopoetic stem cell transplantation (HSCT)