Substratversorgung von NO-Synthasen

Resultate dieser Arbeit zeigen, dass endotheliale und neuronale NO-Synthasen (eNOS und nNOS) ihr Substrat Arginin nicht ausschließlich aus extrazellulären, sondern auch aus intrazellulären Quellen beziehen. Das Substrat aus den intrazellulären Quellen scheint nicht über Membrantransporter in den Extrazellulärraum gelangen zu können. Dies deutet darauf hin, dass eine enge Assoziation der Arginin-bereitstellenden Enzyme mit eNOS bzw. nNOS vorliegen könnte. Dadurch würde das durch diese Enzyme generierte Arginin direkt an die NOS weitergereicht und nicht über Transporter gegen andere basische Aminosäuren (AS) im Extrazellulärraum ausgetauscht werden. Eine intrazelluläre Substrat-Quelle besteht aus dem so genannten „Recycling“, der Umwandlung des bei der NO-Synthese entstehenden Citrullins in Arginin. Eine Kopplung von Arginin-bereitstellenden „Recycling“-Enzymen mit NOS wird in Endothelzellen und teilweise auch in TGW-nu-I Neuroblastomzellen beobachtet, nicht jedoch in A673 Neuroepitheliomzellen. Die Kopplung scheint daher vom Zelltyp abhängig zu sein. Das zur Arginin-Regeneration benötigte Citrullin kann allen untersuchten Zellen durch den Austausch mit spezifischen neutralen AS, die ausschließlich zum Substratprofil des System N Transporters SN1 passen, entzogen werden. Die Anwesenheit von SN1-Substraten im Extrazellulärraum führt daher indirekt zu einer Depletion der Recycling-Quelle. SN1 mRNA ist in allen untersuchten Zellen nachweisbar. Aus Protein-Abbau stammendes Arginin stellt den zweiten Teil der intrazellulären Arginin-Quelle dar. Dieser ist in allen untersuchten eNOS- oder nNOS exprimierenden Zellen vorhanden. Das Arginin stammt dabei sowohl aus lysosomalem als auch proteasomalen Proteinabbau, wie der Einsatz spezifischer Inhibitoren zeigt. Extrazelluläres Histidin (aber keine andere Aminosäure) kann diese Arginin-Quelle depletieren. Wir vermuten deshalb, dass Histidin über den Peptid-Histidin-Transporter PHT1, der in allen untersuchten Zellen stark exprimiert ist, gegen die durch lysosomalen und proteasomalen Proteinabbau entstehenden Arginin-haltigen Di- und Tripeptide ausgetauscht wird. Der wichtigste endogene NOS-Inhibitor, asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA), ein Marker für endotheliale Dysfunktion und Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen, stammt ebenfalls aus Proteinabbau. Die Verfügbarkeit dieser intrazellulären Arginin-Quelle wird deshalb stark vom Methylierungsgrad des Arginins in den abgebauten Proteinen abhängen. Eine lokale ADMA-Anreicherung könnte eine Erklärung für das Arginin-Paradox sein, der unter pathophysiologischen Bedingungen beobachteten Verminderung der endothelialen NO-Synthese bei anscheinend ausreichenden intrazellulären Argininkonzentrationen. Da auch in neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer, ADMA eine Rolle zu spielen scheint, könnte das Arginin-Paradox auch für die nNOS-vermittelte NO-Synthese von Bedeutung sein. Die Resultate demonstrieren, dass die Substratversorgung der beiden NOS-Isoformen nicht ausschließlich von kationischen Aminosäuretransportern abhängig ist, sondern auch von Transportern für neutrale Aminosäuren und Peptide, und außerdem von Arginin-bereitstellenden Enzymen. Der jeweilige Beitrag der verschiedenen Arginin-Quellen zur Substratversorgung der NOS ist daher abhängig vom Anteil der jeweiligen Aminosäuren und Peptide in der extrazellulären Flüssigkeit.Results of this work demonstrate that the substrate of endothelial and neuronal NO-synthases (eNOS and nNOS), the cationic amino acid L-arginine, can be derived not only from extracellular but also from intracellular sources. Arginine from the intracellular sources is not exchanged against other cationic or neutral amino acids in the extracellular space via plasma membrane transporters. It seems therefore that there may be a close association of eNOS and nNOS with arginine-providing enzymes. Arginine generated by these enzymes would thus be passed directly to NOS. One part of the intracellular source consists of the so-called “recycling”, the conversion of citrulline, generated during NO synthesis, back to arginine. A coupling of arginine-providing “recycling”-enzymes to NOS is observed in endothelial cells and partly in TWG-NU-I neuroblastoma cells, but not in A673 neuroepithelioma cells. The coupling seems therefore to be dependent on the cell type. Citrulline required for arginine regeneration can be depleted by neutral amino acids that match the substrate profile of system N transporter 1 (SN1). The presence of substrates of SN1 in the extracellular fluid is thus responsible for the depletion of the recycling source. SN1 mRNA could be detected in all cell types investigated. Arginine derived from protein degradation is the second part of the intracellular arginine source. This part is available in all eNOS and nNOS expressing cells examined. As demonstrated by the use of specific inhibitors, arginine derives from lysosomal as well as from proteasomal degradation. Extracellular histidine (but no other amino acid) can deplete this arginine source. We therefore suppose that histidine can be exchanged against arginine-containing di- and tripeptides derived from lysosomal and proteasomal protein degradation presumably via the peptide-histidine-transporter 1 (PHT1), which is strongly expressed in all tested cells. The most important endogenous NOS inhibitor, asymmetrical dimethyl arginine (ADMA), derives also from protein breakdown. The availability of this intracellular source would thus be dependent of unmethylated arginine residues in the degraded proteins. ADMA is a marker of endothelial dysfunction and a risk factor for cardiovascular diseases. A local accumulation of ADMA could explain the arginine paradox: the reduction of endothelial NO synthesis under pathophysiological conditions at apparent sufficient intracellular arginine concentrations. The arginine paradox could in addition be important for NO synthesis from nNOS since ADMA plays a role in neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s disease. The results demonstrate that substrate supply of both NOS isoforms is not only dependent on cationic amino acid transporters but also on transporters for neutral amino acids and peptides and also on arginine-providing enzymes. The particular contribution of each individual arginine source is therefore dependent of the extracellular concentrations of these amino acids and peptides