Untersuchungen zur Beteiligung der Preseniline an den molekularen Mechanismen der Amyloid-ß Entstehung

ZusammenfassungMorbus Alzheimer ist eine progressive, neurodegenerative Erkrankung, die weltweit die häufigste Form der Demenz darstellt und im mittleren bis späten Lebensabschnitt auftritt. Die neuropathologischen Merkmale beinhalten das Auftreten von extrazellulären Ablagerungen aus fibrillogenem Aß42 Peptiden in senilen Plaques und intraneuronalen Akkumulationen von hyperphosphoryliertem Tau in sogenannten neurofibrillären Bündeln. Obwohl die meisten Alzheimer Fälle sporadisch und Alters-assoziiert auftreten, gibt es eine autosomal dominant vererbte Form (FAD; Familial Alzheimer Disease), die schon in einem frühen Lebensabschnitt (ab 28 Jahren) ausbrechen kann. Diese aggressive Alzheimer Form wird durch Mutationen im Amyloid-Precursor-Protein-Gen (APP) oder den Presenilin-Genen (PS-1 und PS-2) ausgelöst. Die Presenilin (PS) Proteine sind entscheidend an der Entstehung von Aß beteiligt. So erhöhen FAD-assoziierte Mutationen in PS-1 und PS-2 die Bildung von Aß42. Außerdem verhindern sowohl homozygote PS-1 Null-Mutationen (PS-1-/-) in transgenen Mäusen, als auch dominant negative PS-1 Mutationen in Kulturzellen die Ab Bildung. Diese Belege sprechen für die zur Zeit favorisierte Amyloid Hypothese, in der die toxische Wirkung des Aß-Peptides in der Entstehung der Alzheimer Erkrankung eine zentrale Rolle einnimmt. Die y-Sekretase ist eine Protease, deren Aktivität für die Entstehung von Ab aus dem Vorläuferprotein APP essentiell ist. Damit bildet sie einen möglichen Ansatzpunkt, um grundlegend in den Prozeß der Ab Bildung einzugreifen. Die y-Sekretase ist allerdings noch nicht identifiziert oder kloniert. Es gibt Hinweise, daß die Preseniline y-Sekretase Aktivität besitzen könnten. Diese Theorie ist bis heute jedoch nicht eindeutig belegt. In dieser Arbeit sollten die molekularen Mechanismen der Ab Entstehung und insbesondere die Beteiligung der Preseniline an diesem Prozeß untersucht werden. Dazu wurde zunächst die subzelluläre Verteilung der endogenen Preseniline analysiert. Es konnte erstmalig ein Unterschied in der subzellulären Verteilung zwischen PS-1 und PS-2 festgestellt werden. PS-1 war vorwiegend im ER lokalisiert, wogegen PS-2 stark im Golgi-Apparat angereichert war. Im zweiten Teil der Arbeit wurde nach möglichen Interaktionen der Preseniline mit C-terminalen APP Fragmenten gesucht, die die Substrate der y-Sekretase darstellen. Es konnte gezeigt werden, daß die Preseniline mit einem 21 kDa großen C-terminalen APP Fragment interagieren. Dabei band die Mutante-Form der Preseniline mehr C-terminales APP Fragment als die Wildtyp-Form. Weiterhin wurde ein zellfreies System zur indirekten Bestimmung der y-Sekretase Aktivität etabliert. Mit Hilfe dieses Systems wird es möglich, Inhibitoren der y-Sekretase zu identifizieren. Die Spezifität des zellfreien Testsystems konnte dadurch deutlich gemacht werden, daß das PS-1, das schon in Zellkultur als essentielle Proteinkomponente zur Entstehung von Aß beschrieben wurde, auch in diesem zellfreien y-Sekretase System notwendig war. Allgemeine Proteaseinhibitoren, die alle bekannten Proteasemechanismen abdeckten, zeigten keinen Einfluß auf die de novo Bildung von Aß. Es konnte festgestellt werden, daß neben der y-Sekretase als Aß produzierende Protease auch Aß abbauende Proteasen vorlagen. Das pH- Optimum der y-Sekretase wurde im neutralen Bereich festgestellt. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß die y-Sekretase eine transmembrane oder zumindest membranassoziierte Protease ist, die keine cytosolischen Komponenten benötigt.SummaryMorbus Alzheimer (AD) is the most common neurodegenerative disorder, accounting for about 50-70% of the typical late-onset cases of dementia. The major histopathological hallmarks in AD are the presence of large numbers of neuritic plaques and neurofibrillary tangles. Neuritic plaques in the brain of affected individuals consists largely of the pathologically relevant 42-amino acid amyloid ß-peptide (Aß42), which is derived from proteolytic processing of the ß- amyloid precursor protein (APP). AD appears to occur as a sporadic disease, however, in a substantial minority the disease is inherited as an autosomal dominant trail (familial AD or FAD). FAD-associated mutations in the APP gene and the Presenilin (PS) genes alter APP processing in the way that they enhance the production of the Aß42. The two homologous PS proteins play a key role in Aß generation since a gene knockout and dominant negative mutations of the presenilins significantly inhibit total Ab production. These evidences support the 'amyloid cascade hypothesis', in which the generation and aggregation of the neurotoxic Aß-peptide assumed to be the initial step in the formation of AD. In the proteolytic processing of APP a protease termed y-secretase is essential for the generation of the amyloidogenic Aß42. Therefore this protease is a target for pharmacological intervention to prevent the generation of the amyloidogenic product. The y-secretase has not been identified or cloned. There are some findings that the presenilins could have y-secretase activity, but this has to be confirmed. In this Ph.D. thesis I investigated the molecular mechanisms of the Aß generation especially the participation of the presenilins in this process. For that I analyzed the subcellular distribution of the endogenous presenilins in hepatic tissue. I found a difference in the distribution between PS1 and PS2. PS1 was predominantly located in the ER, whereas PS2 was enriched in the Golgi- complex. In the second part of my Ph.D. thesis I investigated the possible interaction of the presenilins with C-terminal fragments (CTF) of APP, which represents the y-secretase substrates. I could show that the presenilins interact with a 21 kDa APP-CTF. In addition, a FAD-mutant form of the presenilins bound more APP-CTF than the wildtype form. Furthermore, I established a cell free test system to measure y-secretase activity indirectly by monitoring a de novo generation of Aß. With this test system it is possible to identify y-secretase inhibitors. In order to proof the specificity of the cell free y-secretase system, I could demonstrate that PS1, which has been described as an essential component for Aß generation in cell culture, is necessary in this cell free y-secretase test system as well. General protease inhibitors showed no influence in the de novo generation of Aß. I found a calcium dependent Aß degrading protease, which is active beside the y-secretase as the Aß producing protease. The pH optimum of the y-secretase had been identified in the neutral range. Furthermore, I could demonstrate that the y-secretase is a transmembrane protease, which is active without further cytosolic components