Overcoming Hurdles in Downstream Processing of Tobacco-derived Biopharmaceutical Proteins

Monoklonale Antikörper (mAks) haben im vergangenen Jahrzehnt die Landschaft der biopharmazeutischen Industrie dominiert und werden diese Vormachtstellung vermutlich auch noch einige Zeit behaupten. Dies liegt an der Vielseitigkeit ihrer Einsatzmöglichkeiten, z.B. in der Krebstherapie. Typischerweise werden mAks in Säugerzellen, z.B. Chinese hamster ovary (CHO) Zellen, hergestellt. In der Folge haben sich biopharmazeutische Unternehmen auf dieses Expressionssystem fokussiert um das mittlerweile eine ganze Industrie entstanden ist. Trotzdem ist in den letzten Jahren festzustellen, dass das Interesse an Biopharmazeutika, die in Pflanzen produziert wurden, steigt. Der Grund dafür ist die wachsende Anzahl und Diversität von biopharmazeutischen Proteinen bei denen es sich neben mAks auch um proteinbasierte Toxine (z.B. Visumin aus der Mistel (Viscum album)) oder Enzyme wie Glycocerebrosidase handelt. Diese Substanzen können u.a. in der Krebstherapie oder zur Behandlung von Stoffwechselerkrankungen wie Morbus Gaucher eingesetzt werden. Im Mai 2012 erhielt eine in Karottenzellen von Protalix Biotherapeutics hergestellte Glycocerebrosidase als erstes Biopharmakum aus Pflanzen die Zulassung für die Anwendung im Menschen durch die FDA und konkurriert seither das erfolgreich mit dem in Säugerzellen produzierten Gegenstück. Zusammen mit der Veröffentlichung der ersten Richtlinien für die Herstellung von Biopharmazeutika in Pflanzen durch die regulatorischen Behörden der USA und der EU ist es wahrscheinlich, dass eine steigende Anzahl pflanzlich hergestellter Proteine in klinischen Phasen getestet und letztlich auch in den Markt eintreten werden. Entsprechend ist mit einem Bedarf an Produktionskapazitäten für diese Proteine zu rechnen, die aktuell jedoch vor allem nur in den USA vorhanden sind. Seit 2009 ist das Fraunhofer-Institut für Molekularbiologie und Angewandte Oekologie IME die einzige Einrichtung in der EU, die eine behördliche Genehmigung für die pflanzliche Herstellung von rekombinanten Proteinen für klinische Studien besitzt. Mehr als sieben Chargen des gegen HIV gerichteten mAks 2G12 wurden bereits erfolgreich hergestellt. Generell können Proteine auf zwei verschiedene Arten in Pflanzen hergestellt werden. Transiente Expression beruht auf dem Transfer der für das Produkt kodierenden DNA Sequenz in die Pflanzenzellen durch Viren oder im Prozessmaßstab häufiger verwendet durch Infiltration mit Agrobacterium tumefaciens. Diese Methode ermöglicht die Herstellung von Proteinen innerhalb von zwei Wochen nachdem ihre DNA-Sequenz bekannt ist. Außerdem sind die Produkttiter bei dieser Methode oft höher als bei transgenen Pflanzen. Letztere haben allerdings die Vorteile, dass ihr genetischer Status klar definiert ist und sogenannte Master und Working Seed Banks ähnlich den Master Cell Banks bei Zellkulturen erstellt werden können. Außerdem zeigen transgene Pflanzen sehr reproduzierbare Produktausbeuten, was günstig für die Beurteilung des Prozesses durch die Behörden sein kann, da diese Konsistenz zwischen Produktionschargen als Qualitätskriterium der Herstellungsprozesse auffassen. Weiterhin sind Prozesse die auf transgenen Pflanzen basieren einfacher zu skalieren, da im Gegensatz zur transienten Expression nicht jede Pflanze einer speziellen Behandlung unterzogen werden muss, durch die eine Produktbildung initiiert wird, sondern die Pflanzen per se das Produkt herstellen können. Entsprechend sind transgene Pflanzen gut für die Herstellung von biopharmazeutischen Proteinen im Großmaßstab geeignet. Vor allem Tabak (Nicotiana tabacum) hat sich zu einer Standardproduktionsplattform entwickelt, wobei die Zielproteine typischerweise aus der Blattmasse extrahiert werden. Bei dem resultierenden Rohextrakt (Figure I-1) handelt es sich um ein problematisches Prozessintermediat, da er nicht nur eine große Anzahl von Partikeln im Mikro- und Millimeterbereich enthält, sondern auch eine hohe Konzentration pflanzlicher Metabolite und Proteine aufweist. Während die Partikel die Kapazität von zur Klärung eingesetzten Filtern herabsetzen, können Metabolite und vor allem pflanzliche Proteine einen negativen Einfluss auf nachfolgende chromatographische Reinigungsschritte oder das Produkt haben, z.B. durch proteolytische Aktivität. Als Folge können bei pflanzenbasierten Prozessen die Produktreinigungskosten mehr als 80% der gesamten Prozesskosten ausmachen. Diese hohen Kosten haben zu Diskussionen geführt, ob pflanzlich hergestellte Biopharmazeutika überhaupt wirtschaftlich konkurrenzfähig hergestellt werden können. Daher beschäftigen sich die in dieser Dissertation beschriebenen Arbeiten mit Strategien welche die Kosten der Produktreinigung aus Pflanzen reduzieren und somit die Konkurrenzfähigkeit dieses Expressionssystems verbessern sollen. Auf der einen Seite wurde ein etablierter Filtrationsprozess optimiert, d.h. die Anzahl der Tiefenfiltrationsschritte wurde von drei auf einen reduziert. Dadurch konnten die entsprechenden Verbrauchsmittelkosten um 50% gesenkt werden während sich die Handhabung des Systems und seine Abgeschlossenheit verbesserten. Der letzte Punkt wird vor allem auch für Prozesse die auf transiente Expression zurückgreifen wichtig sein, da dort mit S1-Bakterien gearbeitet werden muss. Außerdem wurden Hitzefällungsmethoden zur Entfernung von pflanzlichen Proteinen aus Rohextrakt standardisiert und für eine Maßstabsvergrößerung vorbereitet (Figure I-2). Auf der anderen Seite wurde ein kombinierter Ansatz aus experimentellen und modellgestützten Untersuchungen verfolgt mit dem eine Datenbank der häufigsten Tabakproteine erstellt wurde welche wiederrum zur wissensbasierten Vorhersage des chromatographischen Trennverhaltens dieser Proteine genutzt wurde. Dieser Ansatz wird in Zukunft eine vereinfachte und beschleunigte Prozessentwicklung für die Reinigung von biopharmazeutischen Proteinen aus Tabakextrakt ermöglichen, was wiederrum die Wettbewerbsfähigkeit dieses Expressionssystems verbessern wird. Die erzeugten Modelle können darüber hinaus auch mit solchen der Proteinexpression kombiniert werden, wie sie für Tabak bereits etabliert wurden und so zu einer ganzheitlichen Prozessbeschreibung im Sinne eines QbD Ansatzes dienen (Figure I-3)