Determination of the spatial structure and comparative analysis of selected inhaled allergens and their complexes with antibodies

Wydział BiologiiAlergie towarzyszą człowiekowi niemal od zarania dziejów. Już w starożytnym Egipcie, Mezopotamii i Grecji znano reakcje alergiczne na pewne substancje. Alergią nazywamy stan, w którym organizm reaguje na substancję niegroźną w sposób gwałtowny i nieadekwatny do poziomu rzeczywistego zagrożenia. Reakcja alergiczna może występować pod wpływem różnych czynników i pod różnymi postaciami. Astma, wysięk z nosa, wysypka, problemy pokarmowe to tylko główne schorzenia związane z alergią. Astma jest jedną z najczęstszych (Masoli et al., 2004) i jedną z najpoważniejszych chorób dróg oddechowych, która może być powodowana przez alergeny wziewne (Busse and Lemanske, 2001). Przebieg astmy może być ostry lub chroniczny i ekspozycja na pyłek, ślinę i naskórek zwierzęcy, odchody roztoczy kurzu domowego, różne substancje karalusze, a także substancje niebędące alergenami mogą spowodować atak astmy. Poznanie struktury pneumoalergenów oraz próba zrozumienia molekularnych podstaw oddziaływań pomiędzy badanymi alergenami i przeciwciałami może przyczynić się do opracowania w przyszłości odpowiedniej terapii immunologicznej a tym samym zmniejszenia objawów astmy u osób nią dotkniętych. Głównym elementem tezy doktorskiej było zbadanie molekularnych podstaw oddziaływania głównego alergenu Grupy 1 z roztocza kurzu domowego pochodzącymi z Europy Der p 1 (skórożarłoczek skryty - Dermatophagoides pteronyssinus) oraz roztoczy kurzu domowego pochodzącymi z Ameryki (Dermatophagoides farinae) Der f 1 z przeciwciałami monoklonalnymi 4C1, 5H8 oraz 10B9. Została przeprowadzona szczegółowa analiza powierzchni oddziaływania epitopu oraz paratopu w otrzymanych kompleksach alergenu z przeciwciałami. Zbadanie alergenu Bla g 4 pochodzącego z karaczana prusaka (Blatella germanica) było kolejną częścią projektu poznania pneumoalergenów. Alergen ten należy do lipokalin – rodziny białek wiążących małe cząsteczki. Lipokaliny charakteryzują się stosunkowo niewielkim zachowaniem ewolucyjnym na poziomie sekwencji, ale silnym na poziomie struktury. Funkcja Bla g 4 oraz ligand wiązany przez to białko są nieznane. Rozwiązanie struktury Bla g 4 umożliwiło identyfikację ligandu, a przeprowadzenie analiz strukturalnych, sekwencyjnych oraz filogenetycznych najbliższego homologa – Per a 4 oraz innych spokrewnionych alergenów umożliwi w nieodległej przyszłości poznanie ich wzajemnych relacji. Poznanie struktury oraz zbadanie homologów alergenu Alt a 1 było ostatnią częścią projektu. Alergen Alt a 1 pochodzi z pleśni Alternaria alternata występującej powszechnie w klimacie umiarkowanym. Alt a 1 jest alergenem o nieznanej strukturze i funkcji. Rozwiązanie struktury, oraz analizy sekwencyjne i filogenetyczne będą pierwszym krokiem do przyszłych badań nad tym alergenem. Kompleksy alergenu Der p 1 z przeciwciałami 10B9 oraz 5H8, a także przeciwciała 10B9 w niezwiązanej formie dostarczyły unikatowej okazji do przeanalizowania sposobu wiązania regionów determinujących komplementarność przeciwciał do epitopów. Bardzo bliskie pokrewieństwo Der p 1 oraz Der f 1 oraz różnorodność otrzymanych struktur umożliwiła porównanie zmian zachodzących podczas wiązania przeciwciał, a także rodzajów uwarunkowań molekularnych do ich wystąpienia. Umożliwiło to porównanie zmian zachodzących podczas wiązania przeciwciała 10B9 do Der p 1 w kontekście otrzymanej uprzednio struktury alergenów Der p 1 i Der f 1 z podwójnie swoistym przeciwciałem 4C1. Otrzymane wyniki prowadzą do wniosku, że nawet takie same lub prawie identyczne epitopy mogą zachowywać się zgodnie zarówno z modelem „klucza i zamka” jak i modelem indukowanego dopasowania Identyfikacja reszt aminokwasowych odgrywających znaczącą rolę w oddziaływaniach alergenu z przeciwciałami oraz zrozumienie strukturalnych podstaw komplementarności między nimi może zostać wykorzystane w projektowaniu alergenów o epitopach charakteryzujących się obniżoną siłą wiązania przeciwciał do celów immunoterapii alergenowej. Dzięki krystalografii rentgenowskiej możliwe było poznanie szczegółów oddziaływania alergenu Bla g 4 z tyraminą, a dzięki analizie struktur oraz sekwencji białek homologicznych, będących także alergenami, poznanie zachowanego ewolucyjnie miejsca i sposobu wiązania tego ligandu wśród pokrewnych alergenów. Okazuje się, że nawet najbliższy homolog Bla g 4 - Per a 4 pochodzący z karalucha amerykańskiego (Periplaneta americana) nie ma zachowanych kluczowych aminokwasów odpowiedzialnych za wiązanie tyraminy i oktopaminy, więc najprawdopodobniej wiąże inne ligandy oraz pełni inną funkcję. Poznanie struktury alergenu Alt a 1, jako unikalnej dimerycznej β-baryłki, a także jako pierwszej z całej rodziny białek z grzybów o nieznanej funkcji jest pierwszym krokiem w celu dalszych badań nad funkcją oraz powiazaniem struktury z funkcja, co może doprowadzić do opracowania nowych form immunoterapii dla osób uczulonych na ten alergen. Uzyskanie struktur krystalicznych za pomocą rentgenografii krystalograficznej oraz analizy molekularnych podstaw oddziaływania alergenów z przeciwciałami; analizy strukturalnej wraz z sekwencyjną między homologicznymi alergenami może w przyszłości zostać wykorzystana do celów farmaceutycznych. Wyniki tych badań pokazują, że zastosowanie połączenia różnych technik umożliwia otrzymanie optymalnych rezultatów.Human kind has been troubled by allergies since the beginning of written history. Allergic reactions to certain substances have been known even in the ancient Egypt, Mesopotamia or Greece. What we call an allergy is a state when organism reacts to otherwise unharmful substance in the violent and inappropriate manner to real danger posed by the given substance. An allergic reaction can occur under the influence of different factors and different forms. Asthma, rhinitis, rash, digestive problems are the main ailments related to allergies. Asthma is one of the most common (Masoli et al., 2004) and one of the most serious diseases of the airways caused by inhaled allergens (Busse and Lemanske, 2001). The course of asthma may be acute or chronic, and asthma attacks may be caused by exposure to pollen, animal saliva, animal dander, feces of the house dust mites, cockroach particles, as well as certain non-allergenic. The elucidation of pneumoallergen structures and an attempt to understand the molecular basis of the interactions between analyzed allergens and antibodies may contribute to the development of the proper immunotherapy and thus reduce asthma symptoms in people affected by it. The main part of this project was to analyze the molecular basis of the interaction between Group 1 major allergens from house dust mites – Der p 1 coming from European house dust mite (Dermatophagoides pteronyssinus) and Der f 1 coming from American house dust mite (Dermatophagoides farinae) with 4C1, 5H8 and 10B9 monoclonal antibodies. A detailed analysis of the interaction surface between the epitopes and the paratopes of the obtained complexes has been conducted. The analysis of the Bla g 4 allergen coming from German cockroach (Blatella germanica) was another part of the project concerning pneumoallergens. This allergen belongs to lipocalin protein family, which usually bind small ligands. The lipocalins are characterized by their relatively low sequence conservation, but strong structural similarity. The function of Bla g 4 as well as the ligand it binds were previously unknown, but the structure determination of Bla g 4 presented herein allowed for the identification of the ligand. The analysis of the structure and sequence of the closest homolog – Per a 4 as well as other homologous allergens allow recognition of interrelationships. The elucidation of the structure of Alt a 1 was the last part of the project. The Alt a 1 allergen comes from black mold (Alternaria alternata), which is common in the outdoor environment in the mild climate zones and is a major health hazard for humans when . Both the structure and the function of the Alt a 1 allergen are unknown. The structure solution together with the analysis of its sequence is the first step for the future research. The Der p 1 allergen complexed with monoclonal antibodies 10B9 and 5H8, as well as 10B9 antibody in its uncomplexed form provided a unique opportunity to study the mechanics of the binding of the complementarity determining regions to the epitopes. A very close homology between the Der p 1 and Der f 1 allergens together with the variety of the obtained structures allowed for the comparison of the changes undergoing upon the binding of the antibodies, as well as the molecular determinants involved in this process. This includes the changes in the conformation of the 10B9 antibody and the comparison with the results of previous study on the binding of the cross-reactive antibody 4C1 by Der p 1 and Der f 1. The obtained results show that both “lock and key” and “induced fit” binding models can coexist even in the same area of the epitopes. The identification of the amino acid residues having important role in the allergen-antibody interactions and the understanding of the molecular basis of the complementarity between them can be used in the design of allergens with the epitopes of lesser affinity to the given antibodies that may be beneficial in immunotherapy. Thanks to x-ray crystallography, it was possible to study the details of the Bla g 4 allergen with tyramine, and as a result of the analysis of the structures together with the sequences of its homologs, it was possible to determine the conservation level of the binding site. This, in turn, provided clues to the ligand binding among homologs related to Bla g 4. It turned out that even the closest homolog to Bla g 4 – the Per a 4 allergen from the American cockroach (Periplaneta americana) does not have conserved key amino acids responsible for the binding of tyramine or octopamine, thus most likely it binds to other ligands and serves a different purpose. Revealing the Alt a 1 allergen structure as a unique dimeric β-barrel protein, as well as solving it as a first structure of the whole protein family of unknown function and exclusive to fungi, is the first step for further research and identifying structure-function relationship, which can lead to the development of the new forms of immunotherapy for Alt a 1 sensitive patients. The knowledge gained by the elucidation of the crystal structures with x-ray crystallography methods, together with the result of the analysis of the molecular basis of allergen-antibody interactions as well as the structure and sequence analysis between the homologous allergens, may be used in the future for the pharmaceutical purposes. The outcome of the experimental and theoretical approach presented herein shows that the combination of different techniques provides more information than just the sum of the individual results