Caracterización de los linfocitos T Cd4 específicos de Rotavirus

En la infección por rotavirus los linfocitos T CD4 son importantes porque estimulan a los LB a que produzcan anticuerpos IgA protectores. El objetivo principal del estudio fue caracterizar los linfocitos T CD4 humanos específicos de rotavirus. Por métodos bioinformáticos se seleccionaron 39 péptidos de rotavirus predichos de ser presentados por moléculas DRB1;0101. Se evaluó la producción de citocinas de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de adultos sanos genotipificados para el HLA estimuladas con los péptidos organizados en grupos. Se realizó la deconvolución de los grupos positivos para identificar los péptidos individuales. Los péptidos seleccionados fueron acoplados con moléculas solubles de HLA DRB1;0101 para formar tetrámeros. CMSP de adultos y niños DR1 fueron teñidas con los tetrámeros, y anticuerpos contra marcadores de migración y diferenciación. Además, se aislaron CMSP, y células mononucleares de intestino humano de adultos para evaluar la producción de citocinas por los linfocitos T, generar líneas de linfocitos T y teñir con los tetrámeros a los linfocitos T. Tres de los péptidos identificados por bioinformática fueron reconocidos por los linfocitos T de adultos en contexto de moléculas DRB1;0101. Dichos péptidos hacen parte de tres proteínas del virus, dos estructurales y una no estructural. Las líneas de linfocitos T generadas a partir de estos voluntarios mostraron ser específicas al reestimularlas con los péptidos específicos. Se observó que en CMSP de adultos sanos y niños vacunados, las células específicas de rotavirus están enriquecidas en células de memoria y que éstas expresan marcadores de migración intestinal. Al comparar la producción de citocinas de CMSP estimuladas con rotavirus, tétanos o virus de la influenza se observó que la respuesta de las células T CD4 contra rotavirus está enriquecida en células productoras de sólo IFN-?, mientras que las de tétanos e influenza están enriquecidas en células multifuncionales.In rotavirus infection, T CD4 lymphocytes are important because they stimulate Blymphocytes to produce protective IgA antibodies. The principal aim of this work was to characterize human rotavirus specific T CD4 cells. Using bioinformatics, 39 rotavirus peptides predicted to be restricted by HLA DRB1;0101 were selected. Cytokine production by PBMC obtained from healthy adults, previously HLA genotyped, were evaluated after stimulation with pools of peptides. To identify individual rotavirus specific peptides, pools were deconvoluted. Selected peptides were assembled with soluble HLA DRB1;0101 molecules to form tetramers. PBMC obtained from DR1 healthy adults and children were stained with tetramers, and antibodies against migration and differentiation markers. Moreover, PBMC and human intestinal mononuclear cells from adults were isolated to evaluate cytokine production by T cells, produce T cell lines and stain the T cells with the tetramers. Three of the peptides identified by bioinformatics, were recognized by CD4 T cells in the context of DRB1;0101. The peptides are derived from two structural and one non-structural rotavirus proteins. Cell lines generated after stimulation with these peptides specifically responded after re-stimulation with the specific peptides. Results also showed that rotavirus specific T cells were enriched in antigenexperienced cells that expressed intestinal migration markers. Comparison of cytokine production by rotavirus specific T cells with those specific for influenza and tetanus toxoid showed that rotavirus specific T cells are enriched in cells producing only IFN-?, whereas tetanus toxoid and influenza specific cells are enriched in multifunctional cells