Bacillus thuringiensis Cyt2Aaトキシンとホスファチジルコリンリポソームの相互作用

Insecticidal toxin of Cyt2Aa produced with Bacillus thuringiensis was proteolytically activated with Proteinase K for60 min or 90 min. Digests from each proteinase K-treatment were analyzed with protein sequencer and it was shown thatin the 60 min-digested peptide, linkage of amino acid residues between 33rd Lysine and 34th Threonine was segregated. Onthe other hand, in the case of 90 min digestion, a few amino acid residues were further chopped off till 38th Serine. Afterpurification of the activated Cyt2Aa, pore-formation activity of it on Phosphatidylcholine-liposome (PC-Lipo) was determinedwith calcein release assay. Cyt2Aa was shown to interact with PC-Lipo with high affinity and the reaction speed was quicklysaturated during 30 min. This fast saturation of the reaction speed is different from that of Cry1A insecticidal toxins, andfurther suggested the different fashion of interactions between Cry1A(s) and PC-Lipo, and Cyt2Aa and PC-Lipo.Bacillus thuringiensis が生産するCyt2Aa は、双翅目昆虫を殺虫する細胞毒性殺虫タンパク質で、その殺虫メカニズムを詳細に解明することは持続可能な農業を実現するために重要である。活性型Cyt2Aa を得るために、プロテネースK により部分分解を行ったところ、反応時間が120分を超えると過度な分解が進行し、活性化断片と考えられる23 kDa の断片が消失した。60分間の反応で得られた23 kDa の消化断片はアミノ酸配列解析の結果、33番目のリシンと34番目のスレオニンの間で切断されていた。一方、90分間の消化処理で得られたペプチドは、さらに38番目のセリンまで4残基が消化切断されていたが、これを最小活性断片であるとし、蛍光物質カルセインを内部に取り込んだ人工脂質膜リポソームを作製し小孔形成活性を測定した。精製したCyt2Aa を、ホスファチジルコリンリポソーム（PC-Lipo）と反応させ、その小孔形成活性を放出されるカルセインの蛍光量から評価した。反応開始30分で小孔形成活性は最大となった。３時間かけて小孔形成活性が最大値に達するCry1A との反応に比べて、Cyt2Aa がPC-Lipo に対して早い破壊活性を持つことが示唆され、Cyt2A とCry1A は異なる反応様式でPC-Lipo に小孔を形成し、Cyt2A は脂質膜とより早く反応すると考えられた