ヒト胚性幹細胞(ES細胞)における自己複製・分化機構の解析

マウスES細胞はLIF存在下で自己複製する。その自己複製には、STAT3の活性化及びOct-3/4の発現が必須である。本研究ではES細胞の自己複製の分子機構を解明する目的で、DNAチップ解析、フィルターハイブリダイゼーション法により候補遺伝子としてZfp57(Znフィンガータンパク質)およびEed(embryonic ectoderm development,ポリコームタンパク質)を同定した。Zfp57はOct3/4と結合し、Oct3/4の標的遺伝子であるRex-1の発現を協同的に促進することが明らかとなった。一方、EedはHDAC(ヒストン脱アセチル化酵素)と複合体を形成し、標的遺伝子の転写抑制に関与する可能性が考えられる。そこでHDACの阻害剤を添加すると、LIF存在下でもES細胞は分化が誘導された。したがって、HDACによる分化誘導因子の発現抑制にEedが関与している可能性が示唆された。さらに、EedがRex-1とも結合することを見いだした。以上の結果から、Oct3/4とSTAT3の標的分子であるZfp57によって誘導されたRex-1がSTAT3標的分子EedやHDACと結合して、ES細胞の分化誘導因子の発現を抑制することによって、ES細胞の未分化状態が維持されている可能性が考えられた。さらに、WntシグナルがサルおよびマウスES細胞の未分化性維持に関与することを示した。WntシグナルはサルES細胞にはLIFと独立に働き、また、マウスES細胞にはLIFと協同的に働き、未分化マーカーであるSSEA-4、アルカリフォスファターゼの発現を維持した。ヒトES細胞は1998年にウイスコンシン大学のThomsonらにより樹立されている。しかし、マウスと異なりヒトおよびサルES細胞はHFに反応しない、一個の細胞からシングルクローンとして増殖できないなど欠点を抱えている。そこで、細胞外からのシグナルではなく、STAT3という細胞内シグナル伝達分子を直接活性化してヒトES細胞を自己複製させることが考えられる。ヒトES細胞にSTAT3ERを遺伝子導入する計画は金沢大学の倫理委員会に実験計画書を申請し、国の機関であるヒトクローン・生殖委員会での指針にもとづく承認を待っている段階である。The pluripotent phenotype of ES cells is maintained in the presence of LIF. LIF binds to a cell surface receptor complex composed of LIF receptor β and gp130, through which several signaling molecules including MAP kinase and STAT3 are activated. We reported that the intracellular domain of gp130 plays an important role in self-renewal of ES cells. In the present study, we examined the signaling pathway through which gp!30 contributes to the self-renewal of ES cells. Mutational analysis of the cytoplasmic domain of gp130 responsible for STAT3 activation is necessary for self-renewal of ES cells, while that required for SHP2 and MAP kinase activation was dispensable. Next, we have constructed a fusion protein composed of the entire region of STAT3 and the ligand binding domain of estrogen receptor. This fusion protein (STAT3ER) was dimerized and activated in the presence of a synthetic ligand 4-hydroxytamoxifen (4HT). When ES cells stably expressing STAT3ER were cultured in the presence of 4HT without LIF and feeder cells, they maintained a morphologically undifferentiated state and expressed undifferentiated state-specific markers (SSEA-1 and alkaline phosphatase). Moreover, ES cells maintained by STAT3ER and 4HT contributed to chimeric mice production when they were injected into blastocysts. These results indicate that STAT3 activation is sufficient to maintain the pluripotency of ES cells. Oct-3/4 transcription factor is expressed in ES cells and ES cells specifically. It is known to be essential for the formation of inner cell mass and for the maintenance of undifferentiated state of ES cells. It is likely that LIF or STAT3 signals inhibit differentiation of ES cells through yet unidentified factor by cooperating with Oct-3/4.研究課題/領域番号:13480204, 研究期間(年度):2001-2002出典：「ヒト胚性幹細胞(ES細胞)における自己複製・分化機構の解析」研究成果報告書 課題番号13480204 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作