Characterizing the mechanical response of epidermal cell monolayers during wound healing

Mención Internacional en el título de doctorEpithelial migration plays an important role during re-epithelization phase in wound healing. Several skin diseases, such as chronic ulcers, fail during this stage. During last years a new insight into this problem has arisen introducing a mechanical point of view of this process. Kinematics and density distribution within the epithelium play key role during collective migration. Besides, the capacity of cells to proliferate and provide the tissue with new cells enhance the ability of them closing the wound. The evolution of the leading edge has shown that experiments performed at starvation stopped at some point whereas those performed at normal condition kept advancing. A deeper study of the velocity fields showed that, cells several rows behind the edge barely moved during the whole experiment. The experiments without proliferation showed a sudden increase in velocity that rapidly decayed after some hours while experiments at normal conditions kept a positive velocity during the whole time. Although velocity profiles showed a completely different behaviour between experiments performed at normal conditions and at starvation, the study of density distribution of cells inside the tissue exhibit almost the same profiles. This result leads to the idea that cells acquire a well-established profile to move, ‘advancing formation’, with lower density at the front where cells with greater velocity are found and many rows behind, confluent cells, which display slower velocity. Cell migration results from the interplay of mechanical and chemical interactions between cells and their extracellular environment. Mathematical in silico models can reproduce experimental results and can predict different future behaviours. Due to the complexity and huge amount of data obtained from in vitro experiments, an emergent need of bioinformatics and mathematical models have appeared although experiments will always be needed. The main advantage is their ability to handle multiple interacting variables simultaneously, which is difficult to deal with in experiments. Here, we introduce the novelty of density field into Banerjee et al. model with the polarization force term proposed by Arciero et al. which mimics better our experimental results and is more physiological. The combination of both has provided good results for the starvation case studied. The temporal evolution of the monolayer length has been fitted to obtain the set of free parameters of the model to be later used to calculate the main variables governing the problem, displacement, density and concentration of contractile units. The real size of the cell culture has shown to be an important factor to be under consideration in regulating the density distribution in the model. Besides, the study of several parameters in the model has shown to exert little influence on the solution. Diffusivity or internal pressure could be then removed from the model without influencing significantly the results. Transepithelial potential (TEP) is defined as the voltage across an epithelium which is the sum of all the voltages of single cell membranes. After epidermis wounding, this transepithelial potential is disrupted inducing endogeneous epithelial electric fields (EEF) that might be implicated in wound reepithelization. In this work we present an epithelial cell monolayer electrical characterization by means of impedance spectroscopy techniques. We have study a wide range of frequencies and three different voltages leading to the conclusion that cell monolayer exhibits a linear impedance behaviour. Given that results, we proposed an equivalent electric circuit to better understand cell-cell and cell-substrate communication. Besides, 2D wound healing assays were performed and external electric fields were applied to force different migration rates improving the ability of cells to migrate towards the wound. Finally, internal calcium concentration was monitored for the different external voltages showing higher concentration in those experiments performed with the largest electric field at the beginning of the experiments. This result suggests that cell-cell communication is enhanced by electric fields improving ion exhange and therefore improving migration rates. This thesis has provided an important knowledge in the physics governing cell migration to Termeg group. We have started a new research line studying collective cell migration, mechanical forces or electric fields involved in the process of wound healing in vitro.La migración de células epiteliales juega un papel muy importante durante la fase de reepitelización en el proceso de cicatrización de heridas, embriogénesis, invasión de cáncer o la respuesta inmune. Muchas afecciones de la piel tales como las ulceras crónicas fallan durante esta fase. Durante los últimos años se ha dado un nuevo entendimiento a este problema estudiándolo desde un punto de vista físico y mecánico. La densidad celular y la velocidad adquirida por las células dentro del epitelio son variables esenciales durante la migración colectiva. Además, la capacidad de las células de proliferar y aportar al tejido nuevas células aumenta la habilidad de cerrar la herida. La evolución temporal de borde de la herida ha demostrado que los experimentos llevados a cabo sin proliferación se paran al cabo de cierto tiempo mientras que los que se realizaron en condiciones normales continuaron avanzando a velocidad constante. Un estudio más detallado de los campos de velocidad mostro que, las capas de células detrás del borde de avance apenas se movieron durante todo el experimento. Los experimentos sin proliferación mostraron que inicialmente el tejido adquiere una velocidad comparable a los experimentos con proliferación pero a las pocas horas la velocidad decayó abruptamente. En cambio en los experimentos en condiciones normales las células mantuvieron una velocidad casi constante aunque también menor con el tiempo y atenuada con la distancia al borde. A pesar de que lo perfiles de velocidad mostraron un comportamiento totalmente distinto entre los dos tipos de experimentos llevados a cabo, con y sin proliferación, el estudio de la distribución de densidades dentro del tejido mostraron perfiles muy similares. Este resultado sugiere la idea de que las células adquieren una "formación de avance" o distribución espacial de densidades bien establecida para poder migrar de manera eficiente. Este perfil muestra bajas densidades en el borde, donde se desarrollan las velocidades más altas y densidad de confluencia a una cierta distancia del mismo, donde las células apenas se mueven. La migración celular resulta de la interacción mecánica y química entre células y el ambiente extracelular que las rodea. Los modelos matemáticos in silico pueden reproducir resultados observados experimentales y pueden predecir comportamientos futuros. Debido a la complejidad y la enorme cantidad de datos que se obtienen de los experimentos in vitro actualmente se requieren de herramientas bioinformáticas y modelos matemáticos para sus análisis, aunque los experimentos siempre sean necesarios. La mayor ventaja es la habilidad de manejar múltiples variables que interaccionan entre si mientras que experimentalmente es más complejo de estudiar. En esta tesis introducimos una mejora al modelo desarrollado por Banerjee et al., incorporando una nueva variable que hemos visto que es imprescindible en la migración celular colectiva, la densidad. Además, se sustituye el término de fuerza de polarización que establece el movimiento por un término más fisiológico, propuesto por Arciero et al. y que representa mejor los fenómenos observados en los experimentos. La combinación de ambos modelos ha proporcionado buenos resultados en la simulación de experimentos sin proliferación. Se ha realizado un ajuste a evolución temporal del borde o tamaño del tejido para obtener los valores de las constantes o parámetros libres del problema para después obtener el resto de las variables que componen el modelo, los desplazamientos, la densidad y la concentración de elementos contráctiles. Por otro lado, se ha observado que tanto la condición inicial del perfil de densidad como el tamaño real del tejido afectan de manera notoria a los resultados que el modelo es capaz de proporcionar. Finalmente se ha estudiado la influencia de los parámetros y por tanto, ciertos términos de las ecuaciones del modelo, resultado que tanto la difusividad y presión interna no juegan un papel muy relevante. El potencial transepitelial (TEP) se define como la tensión que existe a través de un epitelio que resulta ser la suma de todos los voltajes de membrana de las células que lo forman. Tras hacerse una herida en la epidermis este potencial transepitelial se perturba induciendo un campo eléctrico endógeno en el tejido que está implicado en el proceso de reepitelización de la herida. En este trabajo presentamos la caracterización eléctrica de una monocapa celular a través de técnicas de espectroscopia de impedancia. Hemos estudiado un rango de frecuencias muy amplio y se han aplicado tres tensiones alternas diferentes donde el tejido ha mostrado una impedancia lineal. A la luz de los resultados obtenidos se ha propuesto un circuito eléctrico equivalente que intenta reproducir la comunicación célula-célula y célula-sustrato. Además se han realizado experimentos de migración en los que se han aplicado campos eléctricos para forzar distintas respuestas celulares mejorando la habilidad de las células para migrar hacia el espacio libre. Finalmente, se ha monitorizado la concentración de calcio intracelular para distintos voltajes aplicados observando que la concentración de calcio era mayor y en más células en aquellos casos donde el campo eléctrico era más elevado. Esto sólo se observó al comienzo de los experimentos, mientras que a las 24 horas la concentración de calcio era muy similar en todos los casos. Esto sugiere que el campo eléctrico dispara o acelera la comunicación célula-célula y por tanto la coordinación en la migración. Esta tesis ha proporcionado un conocimiento muy importante de la física subyacente en el proceso de migración para el grupo Termeg. Hemos comenzado una nueva línea de investigación en migración celular, fuerzas mecánicas o campos eléctricos involucrados en el proceso de cicatrización celular in vitro.Programa Oficial de Doctorado en Mecánica de FluidosPresidente: Juan Carlos Lasheras.- Secretario: Claudio Jorge Conti.- Vocal: Gustavo Víctor Guinea Tortuer