Multidimensional chromatographic separation techniques for proteome analysis

In der vorliegenden Arbeit wird die Entwicklung eines zweidimensionalen Chromatographiesystems unter Verwendung von monolithischen Poly(Styrol-Divinylbenzol) (PS-DVB) Kapillarsäulen, die sich schon mehrfach für die Analyse von Biomolekülen ausgezeichnet haben, für die Proteomanalyse beschrieben. Die Detektion und Identifizierung der Analyten wurde durch on-line Kopplung der 2. Dimension mit der Elektrospray-Ionenfallen Massenspektrometrie gewährleistet. Um einen hohen Orthogonalitätsgrad für das 2D-HPLC System zu erhalten wurden die PS-DVB Säulen (Ionenpaar-Umkehrphasen Chromatographiemodus, 2. Dimension) mit starken Kationenaustausch(SCX)-Säulen (1. Dimension) kombiniert. Vor der eigentlichen Kopplung wurden die jeweiligen Trenndimensionen zuerst individuell charakterisiert. Für die 1. Dimension wurden sowohl eine analytische 4.0 mm I.D. SCX-Säule als auch mehrere SCX-Kapillarsäulen getestet. Da die beste Trenneffizienz für Proteine und Peptide mit der analytischen SCX-Säule erreicht werden konnte, wurde diese für das 2D-HPLC System ausgewählt. Aufgrund der stark unterschiedlichen Säulendimensionen der SCX-Säule und der PS-DVB Kapillarsäule, die in der 2. Dimension eingesetzt werden sollte, musste die Kopplung der beiden Trenndimensionen off-line über zwei komplett eigenständige HPLC-Anlagen erfolgen. Das Leistungsvermögen und die Zuverlässigkeit der beiden HPLC-Systeme konnte hierbei über detaillierte Charakterisierungen ermittelt werden. Die Aufkonzentrierung und Entsalzung der SCX-Fraktionen aus der 1. Trenndimension wurde mit einer monolithischen PS-DVB Anreicherungssäule (10 x 0.20 mm I.D.) durchgeführt. Für diese Säule wurde ein spezielles Gehäuse entwickelt, mit dem sich 3 - 10 mm lange Kapillarsäulen mit einem Außendurchmesser von 360 µm optimal in Mikro-HPLC Systeme einbinden lassen. Angeschlossen an eine Mikro-HPLC Anlage konnte über Langzeittests eine Druckstabilität von bis zu 400 bar für die Anreicherungssäulenhalterung nachgewiesen werden. Untersuchungen zur Beladbarkeit der monolithischen Anreicherungssäule (10 x 0.20 mm I.D.) über Frontalanalysen ergaben 0.5 bis 1.6 µg für drei verschiedene Proteine (Serum Albumin, Carboanhydrase und Cytochrom C) und 0.6 µg für eine Mischung aus sechs bioaktiven Peptiden. Mit Hilfe der Trennung einer Mischung aus neun Peptiden konnte gezeigt werden, dass die Trenneffizienz von monolithischen Trennsäulen (100 und 200 µm I.D.) durch die Kombination mit einer monolithischen Anreicherungssäule um bis zu 20% erhöht werden konnte. Die Kombination aus beiden Säulen beinhaltete hierbei die Fokussierung der Analyten an der Anreicherungssäule, dann den Transfer der Analyten zur Trennsäule im Backflush-Modus und abschließend die Trennung der Analyten in der Trennsäule. Die Möglichkeit der Aufkonzentrierung von Analyten an der monolithischen Anreicherungssäule konnte mit einer 100-fach verdünnten Proteinmischung bestätigt werden. Bei Injektion gleicher Probenmengen konnte kein signifikanter Einfluss der Proteinkonzentration (unverdünnt oder 100-fach verdünnt) auf die Wiederfindung der Proteine festgestellt werden. Durch Erhöhung der Konzentration des Ionenpaar-Reagenzes sowie durch Verwendung von hydrophoberen Ionenpaar-Reagenzien in dem Eluenten, der für die Aufkonzentrierung der Proben an der Anreicherungssäule verwendet wurde, konnte die Effizienz der Anreicherung, speziell für kleine und hydrophile Peptide, gesteigert und schließlich optimiert werden. Optimale Anreicherungsbedingungen wurden mit 0.1 Vol% Heptafluorbuttersäure im Beladungseluenten erreicht. Das zweidimensionale Chromatographiesystem mit der starken Kationenaustauschsäule in der 1. Dimension und den monolithischen PS-DVB Säulen (Anreicherungs- und Trennsäule) in der 2. Dimension wurde schließlich mit tryptisch verdauten Proteinmischungen detailliert charakterisiert. Mit Hilfe der ausgewerteten Daten konnten unter anderem eine gute Reproduzierbarkeit der Peptididentifikation (46-74% für drei Wiederholungsmessungen) sowie eine zuverlässige Identifizierung von Peptiden/Proteinen bis zu einem dynamischen Konzentrationsbereich von 1 zu 650 nachgewiesen werden. Nach der Entwicklung und Optimierung wurde das zweidimensionale HPLC-System erfolgreich für die Proteomanalyse des Mikroorganismus Myxococcus xanthus DK1622, welcher bekannt für die Produktion von biologisch aktiven Sekundärmetaboliten ist, eingesetzt. Über Datenbankrecherche wurden 1312 unterschiedliche Peptide und 631 unterschiedliche Proteine identifiziert. Unter den 631 Proteinen konnten auch elf Polyketidsynthasen (PKS) und nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPS), welche in die Biosynthese von Sekundärmetaboliten in Myxococcus xanthus involviert sind, identifiziert werden. Mit Hilfe der zahlreichen Peptididentifikationsdaten konnte zusätzlich noch der hohe Grad der Orthogonalität der gekoppelten Trenndimensionen sowie das Elutionsverhalten der Peptide in der starken Kationenaustauschchromatographie (1. Trenndimension) dargelegt werden.In this work we describe the development of a two-dimensional chromatographic system for proteome analyses using monolithic poly(styrene-divinylbenzene) (PS-DVB) capillary columns, which have proven to be very suitable for the analysis of biomolecules. The detection and identification of the analytes were accomplished by on-line coupling of the second dimension with electrospray ion trap mass spectrometry. To ensure a high degree of orthogonality, the PS-DVB columns, which were operated in ion-pair reversed-phase chromatography mode (second dimension), were coupled with strong cation-exchange columns (first dimension). Before coupling the columns, both separation dimensions were characterized individually. For the first dimension we tested an analytical 4.0 mm I.D. strong cation-exchange (SCX) column as well as several SCX capillary columns. Since the best separation efficiency for proteins and peptides was obtained with the analytical SCX column, we chose this column for the 2D-HPLC system. Because of large differences in column dimensions of the analytical SCX column and the PS-DVB capillary columns, both separation dimensions had to be coupled off-line via two completely independent HPLC systems. The performance and the reliability of both HPLC systems were characterised by means of detailed experiments. Preconcentration and desalination of the collected SCX-fractions were accomplished with a monolithic PS-DVB trap column (10 x 0.20 mm I.D.). For this column we developed a special housing, which can be used to connect capillary columns with lengths of 3 — 10 mm and with an outer diameter of 360 µm to micro HPLC systems. Pressure durability tests approved long term stability up to 400 bar for this setup. Frontal analyses revealed loadabilities for the 10 x 0.20 mm I.D. preconcentration column between 0.5 and 1.6 µg for three different proteins (serum albumin, carbonic anhydrase and cytochrome c) and 0.6 µg for a mixture of six bioactive peptides. A 20% decrease in the average peak widths of nine peptides was obtained upon combining an analytical separation column (100 and 200 µm I.D.) with a preconcentration column as compared with a setup using an analytical separation column only. The combination of both columns comprised the focusing of the analytes on the preconcentration column, subsequently the transfer of the analytes to the analytical column in backflush mode, and finally the separation of the analytes in the analytical column. The applicability of monolithic trap columns to concentrate analytes was approved by a 100-fold diluted protein mixture. By injecting the same amounts of proteins we could not determine a significant influence of the protein concentration (undiluted or 100-fold diluted) on protein recovery. Trapping efficiency, especially for small and hydrophilic peptides, was optimized by increasing the concentration of the ion pair reagent and by using more hydrophobic ion pair reagents in the sample loading solvent. Optimal trapping conditions could be achieved with 0.1 vol% heptafluorobutyric acid in the loading solvent. The off-line two-dimensional chromatography system, combining a strong cation-exchange column (first dimension) and two monolithic PS-DVB columns (preconcentration and separation column, second dimension), was charaterized in detail with tryptic protein digests. The evaluated data revealed good reproducibility of peptide identification (46-75% for triplicate analyses) and reliable identification of peptides/proteins up to a dynamic concentration range of 1 to 650. After development and optimisation of the 2D-system we applied this HPLC setup successfully to the proteome analysis of the microorganism Myxococcus xanthus DK1622, which is known to be a potent producer of biologically active secondary metabolites. Upon automated database searching, 1312 unique peptides and 631 unique proteins were identified. Among the 631 proteins we could also identify eleven polyketide synthases (PKS) and nonribosomal peptide synthetases (NRPS), which are known to be involved in the biosynthesis of various secondary metabolites in Myxococcus xanthus. By means of the large peptide identification data the high degree of orthogonality of the coupled separation dimensions as well as the elution behaviour of peptides in strong cation-exchange chromatography (first separation dimension) were additionally demonstrated