Resistencia a herbicidas en poblaciones del género Amaranthus: mecanismos moleculares y expresión de alelos als resistentes en plantas de A. thaliana y trigo

En los agroecosistemas, las malezas son plantas que crecen en un cultivo y que no corresponden a la especie o al genotipo cultivado, lo cual usualmente provoca pérdidas en el rendimiento de la producción de dicho cultivo. El control químico de las malezas se realiza por medio de la aplicación de herbicidas y constituye una de las principales herramientas en la agricultura moderna. El sistema agro-productivo nacional está basado desde hace más de 20 años en el cultivo de soja transgénica resistente a glifosato (ya sea en monocultivo, o bien, en rotación con maíz resistente) junto con la aplicación del herbicida glifosato, o mezclas del mismo con otras clases de herbicidas. La confianza excesiva en este sistema ha llevado a un problema grave relacionado a la evolución de malezas resistentes a herbicidas y a la incesante búsqueda de estrategias químicas alternativas que complementen las ya existentes. El primer caso de resistencia a herbicidas en Argentina fue detectado en 1996, y al día de la fecha existen 15 especies diferentes que han desarrollado resistencia al menos a un herbicida, ascendiendo este número a 255 especies a nivel mundial. Entre ellas, se destacan las especies del género Amaranthus, cuyo éxito radica en sus capacidades de crecimiento, desarrollo y reproducción. Son plantas de metabolismo C4 anuales que emergen después de las heladas de primavera, crecen rápidamente, compiten agresivamente con los cultivos de verano, toleran la sequía, responden a los altos niveles de nutrientes disponibles y están adaptadas para evitar sombras a través de una rápida elongación del tallo. Adicionalmente, presentan una gran variabilidad genética y una inusitadamente alta producción de semillas, que pueden distribuirse y germinar muy eficientemente. El objetivo de esta tesis doctoral consistió en dilucidar las bases moleculares de la resistencia a herbicidas en poblaciones del género Amaranthus, de manera de contribuir al diseño racional de estrategias de control y, eventualmente, al desarrollo de herramientas biotecnológicas. Como resultado de extensas investigaciones a nivel fenotípico y molecular, se pudo confirmar la resistencia cruzada a herbicidas inhibidores de la acetolactato sintasa (ALS) en poblaciones de Amaranthus palmeri y Amaranthus hybridus -las dos malezas más XI problemáticas de Argentina- y develar que la resistencia está causada por mutaciones asociadas al sitio de acción que provocan cambios conformacionales responsables de una resistencia de amplio espectro a todos los inhibidores de la ALS (D376E y W574L). En lo que respecta al glifosato, una de las poblaciones de A. hybridus presentó valores de resistencia extraordinariamente elevados comparados a los casos previamente descriptos. Curiosamente, se pudo asociar este fenotipo de resistencia a un mecanismo de acción completamente novedoso: una triple sustitución aminoacídica en la 5-enolpiruvil-shikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS). Como consecuencia de estos estudios pudieron desarrollarse técnicas que posibilitan la rápida detección de este nuevo mecanismo de resistencia, denominado TAP-IVS, en un alto número de invividuos en simultáneo. Por su parte, las poblaciones de A. palmeri resistentes a glifosato presentaron una alta prevalencia de la sustitución P106S en la EPSPS, y una incipiente amplificación en el gen epsps. Del mismo modo, se comprobó que la resistencia a herbicidas en A. tuberculatus del estado de Ohio (EEUU) es un problema radicado, existiendo una dominancia de la resistencia a glifosato, pero habiéndose detectado niveles mensurables de resistencia a lactofen (inhibidor de la protoporfironógeno oxidasa, PPO) y atrazina (inhibidor del Fotosistema II). Los mecanismos moleculares dominantes fueron la amplificación génica para glifosato y la deleción de la glicina 210 de la PPO para lactofen. No se detectaron mecanismos asociados al sitio de acción en el caso de la resistencia a atrazina. Por último, fue posible el desarrollo de un gen marcador de selección para la transformación de trigo basado en una versión alélica als que codifica para la sustitución en la posición 574, plausible de utilizarse con diferentes principios activos debido al amplio espectro de resistencia otorgado por el gen. La rápida evolución de múltiples mecanismos de resistencia en las últimas décadas, ha reafirmado la necesidad de adoptar estrategias de manejo integradas. La información de los mecanismos moleculares generada resulta clave para el diseño de tácticas de control geo-localizadas que permitan a los productores entender, prevenir y eventualmente sobrellevar de manera sustentable el problema de resistencia en malezas, sin contribuir a la generación de un problema similar a largo plazo.The first case of herbicide resistance in Argentina was detected in Amaranthus hybridus in 1996 and, to date, 15 different species have evolved resistance to at least one herbicide. Moreover, several populations of Amaranthus palmeri (a non-native species) with suspected cross-resistance to ALS-inhibiting herbicides and glyphosate have been repeatedly detected by farmers since 2013. Despite this, no extensive reports of the molecular mechanisms endowing resistance in local Amaranthus species were published in the last decades. The goal of this doctoral thesis was to elucidate the molecular bases of herbicide resistance in problematic populations within the Amaranthus gender, contributing to the rational design of management strategies and, eventually, to the development of biotechnological tools. The cross-resistance to ALS inhibitors was confirmed in populations of A. palmeri and A. hybridus, the two most problematic weeds in Argentina. It was possible to reveal that resistance was caused by target-site mutations (D376E and W574L) that cause conformational changes responsible for a broad spectrum of resistance to all ALS inhibitors families. Moreover, one of the A. hybridus populations also displayed an extraordinarily high level of glyphosate resistance. Interestingly, this phenotype could be associated to a completely novel target-site mechanism: a triple amino acid substitution in the EPSPS protein (TAP-IVS), the target of glyphosate. As a consequence of these studies, some techniques that enable a rapid detection of this new resistance mechanism in a high number of individuals were developed. On the other hand, populations of A. palmeri displaying glyphosate resistance presented a high prevalence of the P106S substitution in the EPSPS, and low leves of epsps gene amplification as an emergent mechanism. Additionally, it was found that herbicide resistance in A. tuberculatus of the Ohio sate (USA) is a serious problem, with a strong dominance of glyphosate resistance, but still measurable levels of lactofen and atrazine resistance. Gene amplification and G210 deletion were found to be the most frequent mechanisms for glyphosate and lactofen resistance, respectively. XIII Finally, it was possible to develop a selectable marker for wheat transformation based on an als allelic version carrying the W574L substitution, allowing the possibility of rotating different active ingredients as selection agents. The rapid evolution of multiple mechanisms of resistance in the last decades has reinforced the need to integrate conventional weed management strategies to non-chemical tactics. Information provided by the molecular mechanisms is key in the design of geo-specific control strategies that allow producers to understand, prevent and eventually cope the problem of herbicide resistant weeds in a sustainable way.Fil: Apellido, Nombre. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias; ArgentinaFil: Larran, Alvaro Santiago. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias; Argentin