Caracterización funcional de acil-lípido desaturasas de Bacillus sp. : determinantes estructurales de la especificidad de sustrato y dadores electrónicos

Los ácidos grasos insaturados (AGI) son componentes esenciales de la membrana celular. Los organismos vivos, en particular los poiquilotermos, responden a una disminución en la temperatura aumentando la proporción de AGI. Este fenómeno ha sido designado con el nombre de adaptación homeoviscosa 1. Los AGI son sintetizados por desaturasas, un tipo especial de oxigenasas que tienen la capacidad de remover dos hidrógenos de una cadena hidrocarbonada, especialmente de cadenas de ácidos grasos (AG), catalizando la formación de un doble enlace en el sustrato en forma altamente estéreo-, regio- y quimio- selectiva 2. Hasta el momento, no se conocen las bases moleculares que expliquen este grado de sofisticación de estas enzimas. La gran mayoría de las desaturasas se encuentran unidas a membrana, lo que dificulta la obtención de grandes cantidades en forma activa, y por consiguiente el entendimiento de las propiedades particulares de su actividad enzimática. El estudio de desaturasas bacterianas con actividades diferentes, sobre sustratos similares, y estructura primaria similar presenta una oportunidad única para llevar a cabo estudios sobre la relación estructura-función de estas enzimas. En bacterias Gram positivas la única desaturasa de AG caracterizada es la Δ5 desaturasa de Bacillus subtilis 3. El análisis de la composición lipídica de cepas de B. subtilis reveló que esta bacteria sintetiza exclusivamente AGI con el doble enlace en la posición 5 y los estudios complementarios realizados revelaron que esta bacteria posee una única acil lípido desaturasa denominada Des que cataliza la introducción de dobles enlaces en la posición 5 con distintos sustratos, no mostrando preferencia por la longitud de cadena 3. Esta desaturasa se induce a bajas temperaturas y su expresión se encuentra regulada por un sistema de dos componentes, DesK-DesR (DesK/R) 4. Estudios realizados por Fulco 5 demostraron que algunas especies de bacilos sintetizaban AGI con el doble enlace en la posición 5, mientras que en otras se encontró un espectro de isómeros de dobles enlaces centrados alrededor de la posición 9 y sobre AG de distinta longitud de cadena6. En Bacillus licheniformis 9259 se observaron tanto AGI en la posición 5 como en la posición 10, y se propuso que al menos dos desaturasas distintas estaban involucradas 7. Otros grupos observaron que Bacillus cereus sintetiza AGI Δ5, Δ10 y Δ5,10 8. Esta diversidad de actividades hacen del género Bacillus una fuente natural de desaturasas que podría ser utilizada para comprender los mecanismos moleculares que gobiernan la especificidad de sustrato. Además, la gran cantidad y diversidad de AGI sintetizados por estos organismos los convierten en excelentes modelos para comprender la funcionalidad de las desaturasas y estudiar los mecanismos que regulan su expresión. Los resultados presentados en este Trabajo de Tesis permitieron contribuir al conocimiento de la función y regulación de las desaturasas de B. cereus ATCC 14579 y B. licheniformis ATCC 14580. Se comprobó que B. licheniformis posee una única acil lípido desaturasa, DesL que tiene actividad Δ5. Cuando cultivos de esta bacteria se transfieren de 37°C a 25°C la cantidad de AGI aumenta 2 veces, de 3% a 6%, lo cual sugirió que la expresión o actividad de esta enzima se encuentra regulada por la temperatura de crecimiento. Posteriormente se pudo demostrar que la expresión del gen desL se encuentra regulada por un mecanismo similar al descripto previamente en nuestro laboratorio para B. subtilis, en el que estaría involucrado un sistema de dos componentes similar a DesK/R. Se determinó que B. cereus posee dos desaturasas denominadas DesA y DesB. Ambas proteínas son acil lípido desaturasas con actividad Δ5 y Δ10, respectivamente. Estas dos enzimas son las responsables de sintetizar la gran cantidad de AGI que produce B. cereus tanto a 37°C (27%) como a 25°C (45%). Este aumento en la síntesis de AGI al disminuir la temperatura de crecimiento se debería a un incremento en la expresión del gen desA y a un aumento en la actividad de DesB, ya que el gen desB se expresaría de manera constitutiva. Estudios fisiológicos realizados con mutantes obtenidas en el gen desA, mostraron que esta desaturasa no es esencial para el crecimiento bacteriano en ninguna condición ensayada. Por otro lado la ausencia de DesB inhibe completamente el crecimiento de B. cereus en medio mínimo (MM). Este defecto no pudo ser corregido por el agregado de AGI exógenos en este medio debido a que el suplemento en este medio fue insuficiente para corregir la deficiencia de AGI o a los efectos líticos que produce el agregado externo de los mismos al medio de cultivo. La recuperación del crecimiento se logró luego del agregado de aminoácidos (AA) precursores de ácidos grasos ramificados (AGR) al medio de cultivo, o de AA no precursores más AGI exógenos. Esto estaría sugiriendo que es necesaria una combinación de AGR y AGI que provean fluidez a la membrana para permitir el crecimiento. En este sentido se pudo determinar que el agregado de precursores de los AGR, en particular la isoleucina, rescata el crecimiento en forma parcial. Los AGR presentan bajos puntos de fusión al igual que los AGI y permiten fluidificar la membrana en ausencia de los mismos. Esta la primera vez que se describe la esencialidad de una desaturasa para el crecimiento bacteriano en estas condiciones. Finalmente, todos los resultados obtenidos en esta Tesis han contribuido a la caracterización de desaturasas del género Bacillus con el fin de comenzar a comprender las bases moleculares que gobiernan el proceso de desaturación. Además la identificación de genes homólogos a desB, esencial para el crecimiento de B. cereus, en otras especies Gram positivas, incluyendo otros patógenos humanos, indica que la información sobre esta proteína descripta en este trabajo podría ser utilizada para el desarrollo de nuevos compuestos antimicrobianos.Fil: Chazarreta Cifré, Lorena. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET); Argentina