Harnessing dendritic cells for cancer immunotherapy

Hintergrund: Dendritische Zellen (DZ) der Haut sind antigen-präsentierende Zellen, die besondere zelluläre Spezialisierungen aufweisen und dadurch Immunantworten mit unterschiedlichen Ergebnissen koordinieren. Die menschliche Haut ist von definierten DZ Subtypen besiedelt, die sich als „Master Regulatoren” des Immunsystems auszeichnen und deshalb gezielt dazu benutzt werden könnten, um kutane Vakzinierungen (Impfungen) zu verbessern. Diese Zellen haben das Potential, langanhaltende Immunität gegen Krankheiten zu induzieren. Haut DZ exprimieren C-Typ Lektin Rezeptoren für die Erkennung und Bindung von Pathogen-assoziierten Antigenen. Langerhanszellen (LZ) exprimieren den Langerin/CD207 Rezeptor, wohingegen DEC-205/CD205 hauptsächlich von dermalen DZ (dDZ) vorgewiesen wird, aber auch zu einem kleinen Anteil von LZ. CD14+ dermale von Monozyten-abstammende DZ besitzen den Mannose Rezeptor (MR/CD206). Es wurde bereits oftmals gezeigt, dass, wenn Antigene (Vakzine) direkt gegen diese spezifischen Rezeptoren mittels monoklonaler Antikörper (mAb) gerichtet werden („Antigen Targeting“), dies in einer deutlichen Zunahme an Immunantworten resultiert. Diese können Toleranz oder Immunität induzieren. Jedoch weiß man nicht viel über die Effizienz des jeweiligen adressierten DZ Subtyps der menschlichen Haut. Die meisten Studien stammen aus Mausmodellen. Aus diesem Grund wird in dieser Dissertation ein ex vivo Ansatz für das Targeting von humanen DZ in situ getestet, und zwar mit mAb gegen Langerin und DEC-205. Immuntherapie hat das Potential, klassische (prophylaktische) Vakzinierungsansätze zu verbessern und könnte sogar dazu beitragen, unzureichend wirkende Chemotherapien gegen Krebs durch rationales Nutzbarmachen des einzigartigen Leistungsvermögens von DZ zu unterstützen oder gar zu ersetzen. Aus diesem Grund ist beabsichtigt, diesen originellen Denkansatz speziell in der humanen Haut, dem Standardorgan für Vakzinierungen, zu studieren und auszutesten. Methoden: Unter Verwendung von humanen Hautbiopsien wurden diese monoklonalen Antikörper intradermal gespritzt und anschließend wurden die ausgewanderten DZ auf Bindungs- und Aufnahmekapazität mittels Durchflusszytometrie getestet. Des weiteren wurden Haut DZ in einem Vakzin-ähnlichen Setting adressiert. Dazu wurde ein Antigen (EBNA1) mit einem definierten Antikörper, anti-DEC-205 oder anti-Langerin, fusioniert. T Zell Stimulation und Induktion von Effektorfunktionen (IFN-, TNF-) wurden auch mittels Durchflusszytometrie eruiert. Zudem wurde die relative Beteiligung der DZ Subtypen (LZ, dDZ) und des adressierten Rezeptors beurteilt. Der anti-Langerin-EBNA1 Fusions mAb wurde im Rahmen dieser Dissertation konstruiert und hergestellt. Resultate: Korrespondierend zum Expressionsmuster dieser Lektin Rezeptoren auf DZ, band der anti-Langerin Antikörper exklusiv an epidermale LZ, der anti-DEC-205 hauptsächlich an CD1amittelstark CD14-negative dDZ, und der anti-MR an CD14+ CD163+ dermalen Zellen. Die migratorischen Haut DZ haben die an sie adressierten Antikörper aus der kultivierten Haut in das Nährmedium transportiert. Der anti-Langerin wird selektiv von LC transportiert, wohingegen der anti-DEC-205 breiter aufgeteilt ist innerhalb der Haut DZ; nur auf CD163+ Makrophagen nicht. Eine erfolgreiche Vakzinierung benötigt den Zusatz von Adjuvantien. Deshalb haben wir den TLR3 Liganden poly I:C ko-appliziert. Das hat in der Folge nur die Aufnahme von anti-DEC-205 gesteigert nicht aber von anti-Langerin. Der humanisierte anti-DEC-205 (Celldex Therapeutics), der bereits in den ersten klinischen Studien verwendet wurde, zeichnet sich durch ein identisches Bindungsprofil aus. Die funktionelle Analyse der Vakzinierungs-Versuche mit anti-DEC-205 oder anti-Langerin fusioniert an das Modellantigen EBNA1, hat, im Vergleich zu Kontrollen, erhöhte Antigen-spezifische T Zell Antworten gezeigt. Noch vorläufige Beobachtungen deuten darauf hin, dass Adressieren an Langerin dem Adressieren an DEC-205 überlegen sein könnte. Schlussfolgerungen: Die Ergebnisse demonstrieren, dass die unterschiedlichen Subtypen der dendritischen Zellen der Haut gezielt und präferenziell mittels anti-Rezeptor Antikörpern adressiert werden können. Die Effektivität von anti-DEC-205 kann durch poly I:C geboostet werden. Die so mit einem Modellantigen adressierten Haut dendritischen Zellen können verstärkte T Lymphozytenantworten bewirken. Insbesondere haben in diesem experimentellen Setting die Langerhanszellen angedeutet, dass sie den anderen Typen von Haut dendritischen Zellen überlegen sein könnten, letztlich auch, um zytotoxische T Zell Antworten auszulösen. Diese Daten sind von klinischer Relevanz. Krebs-Vakzine die aus solchen Tumor-Antigen / anti-DZ Fusions-Antikörpern bestehen, können moderne „Immuncheckpoint“ Therapien unterstützen. Die außerordentlichen immunogenen Fähigkeiten der dendritischen Zellen würden in dieser Kombination vermehrt offengelegt werden. Das würde somit zukünftige Krebs-Immuntherapientherapien verbessern.Background: Dendritic cells (DC) are antigen-presenting cells that display various cellular specialisations to initiate and orchestrate immune responses with different outcomes. The skin is populated by distinct DC subsets that serve as attractive targets for vaccination. They are capable of inducing long-lived protection from disease. Skin DC express C-type lectin receptors for recognition and binding of pathogen-derived antigens. Langerhans cells (LC) express the receptor Langerin/CD207, whereas DEC-205/CD205 is mainly expressed by dermal DC (dDC) and at low levels also on LC. CD14+ dermal monocyte-derived DC possess the mannose receptor (MR/CD206). Directing antigens (vaccines) directly to these receptors using monoclonal antibodies has repeatedly been shown to markedly enhance resulting immune responses, be they immunogenic or tolerogenic. Little is known about how efficiently each dendritic cell subset is targeted in human skin and how potently it elicits T lymphocyte responses. The aim of this thesis was therefore to test an ex vivo approach for targeting DC in situ, within the human skin, with monoclonal antibodies (mAb) against Langerin and DEC-205. Immunotherapy may expand classical (i.e., prophylactic) vaccination approaches and may complement or ultimately perhaps even replace poor-prognosis-chemotherapy in cancer by rationally harnessing these unique DC properties. Therefore, we aimed to study this novel approach specifically in human skin, the standard target organ for vaccines, and address several unknowns therein. Methods: The targeting mAbs were injected intradermally into human skin explants. Binding of these antibodies to the diverse subsets was studied. DC that had migrated out of the skin explants were assessed for their binding and uptake of the targeting antibodies by flow cytometry. Furthermore, skin DC were targeted in situ in a vaccine-like setting with antigen (EBNA1) fused to the antibodies DEC-205/CD205 and Langerin/CD207 recognising DC surface receptors. T cell stimulation and induction of effector function (IFN-, TNF-) were measured by flow cytometry. Importantly, the relative contributions of DC subsets (LC, dDC) and targeted receptors was assessed. The anti-Langerin-EBNA1 fusion antibody was designed and generated within this thesis. Results: Corresponding to the expression patterns of these lectin receptors in skin DC, anti-Langerin mAb was detected exclusively in epidermal LC and DEC-205 mainly in CD1aintermediate CD14- dDC and the MR in CD14+ CD163+ dermal cells. Migratory skin DC carried targeting mAb from skin explants into the culture medium. In contrast to the very selective transport of anti-Langerin mAb by LC, anti-DEC-205 mAb was more broadly distributed in all skin DC subsets, except in CD163+ macrophages. Since effective vaccination requires the addition of adjuvant we co-administered the TLR-3 ligand poly I:C. This enhanced uptake of DEC-205 mAb by all skin DC subsets, whereas Langerin targeting was unchanged and human anti-human MR targeting even dropped due to some adjuvant-induced DC maturation. Human anti-human DEC-205 mAb (Celldex Therapeutics) that is already being applied in first clinical trials for treatment of melanoma showed identical binding patterns. Functional read-out of the vaccination approach targeting with either DEC-205 or Langerin coupled EBNA1 elicited enhanced antigen-specific T cell responses in comparison to controls. Preliminary evidence would suggest superiority of targeting Langerin. Conclusion: The findings of this thesis demonstrate that LC can be preferentially targeted by Langerin mAb. In contrast, DEC-205 mAb can be addressed to all skin DC subsets, whereas the MR is found on CD14+ CD163+ dermal cells. The efficacy of DEC-205 targeting can be boosted by poly I:C. Given the pronounced ability of human DC to efficiently induce potent T cell responses, in particular LC in inducing cytotoxic T cell responses, these observations are of clinical relevance. Optimised cancer vaccines consisting of tumour-antigen / anti-DC antibody conjugates may ultimately reveal their full therapeutic potential in the presence of modern checkpoint inhibitors.by Bakk.biol. Sandra Schaffenrath, MScKumulative Dissertation aus drei ArtikelnZusammenfassung in deutscher SpracheMedical University of Innsbruck, Dissertation, 2016OeBB(VLID)143428