Clonal epidemiology and antimicrobial resistance in Pseudomonas aeruginosa chronic respiratory infections: interpatient transmission and resistome evolution of an international cystic fibrosis clone

[eng] Chronic respiratory infection (CRI) by Pseudomonas aeruginosa is the main cause of morbidity and mortality in cystic fibrosis (CF). During the progression from early infection to chronic non-eradicable colonization P. aeruginosa undergoes a complex evolutionary adaptation and diversification process which eventually leads to a mixed and persistent infecting population in which multidrug resistant variants frequently rise compromising the selection of appropriate antibiotic therapies. In this work the interplay between three key microbiological aspects of these infections was investigated: the occurrence of transmissible and persistent strains, the emergence of variants with enhanced mutation rates (mutators) and the evolution of resistance to antibiotics. Clonal epidemiology, antibiotic susceptibility profiles, contribution of P. aeruginosa classical resistance mechanisms and the role of mutator variants were investigated in two large collections of CF P. aeruginosa isolates from the Balearic Islands and Spain. As well, whole genome sequencing (WGS) was used to decipher the phylogeny, interpatient dissemination, within-host evolution, WGS mutator genotypes (mutome) and resistome of widespread P. aeruginosa clonal complex 274 (CC274), in isolates from two highly-distant countries, Australia and Spain, covering an 18-year period. Finally, due to the Chronic respiratory infection (CRI) by Pseudomonas aeruginosa is the main cause of morbidity and mortality in cystic fibrosis (CF). During the progression from early infection to chronic non-eradicable colonization P. aeruginosa undergoes a complex evolutionary adaptation and diversification process which eventually leads to a mixed and persistent infecting population in which multidrug resistant variants frequently rise compromising the selection of appropriate antibiotic therapies. In this work the interplay between three key microbiological aspects of these infections was investigated: the occurrence of transmissible and persistent strains, the emergence of variants with enhanced mutation rates (mutators) and the evolution of resistance to antibiotics. Clonal epidemiology, antibiotic susceptibility profiles, contribution of P. aeruginosa classical resistance mechanisms and the role of mutator variants were investigated in two large collections of CF P. aeruginosa isolates from the Balearic Islands and Spain. As well, whole genome sequencing (WGS) was used to decipher the phylogeny, interpatient dissemination, within-host evolution, WGS mutator genotypes (mutome) and resistome of widespread P. aeruginosa clonal complex 274 (CC274), in isolates from two highly-distant countries, Australia and Spain, covering an 18-year period. Finally, due to the relevance of aminoglycosides in the management of CF-CRI, the dynamics of P. aeruginosa resistance development to aminoglycosides was also studied in vitro by WGS approaches. Despite discrepancies between molecular genotyping methods, a high degree of genetic diversity was documented among CF isolates from the Balearic Islands and Spain with scarce representation of CF epidemic strains. However, for the first time in Spain, we documented a superinfection with the multidrug resistant Liverpool Epidemic Strain (LES) in a chronically colonized patient. As well, P. aeruginosa CC274, previously detected in several CF individuals from Austria, Australia and France, was detected in 5 unrelated chronically colonized patients from the Balearic Islands and, therefore, this clone-type should be added to the growing list of CF epidemic clones. Subsequent analysis of the whole genomes sequences of P. aeruginosa isolates from the CC274 P. aeruginosa collection provides evidence of interpatient dissemination of mutator sublineages and denotes their potential for unexpected short-term sequence type (ST) evolution and antibiotic resistance spread, illustrating the complexity of P. aeruginosa population biology in CF. As well, epidemiological studies demonstrated the coexistence of two divergent lineages but without evident geographical barrier. Antibiotic resistance significantly accumulated overtime accompanied by hypersusceptibility to certain antibiotics such as aztreonam, which can be explained in terms of collateral susceptibility. Correlation between phenotypes and WGS genotypes of clonal isolates from the CC274 collection allowed us to define the mutational resistome of CF P. aeruginosa which extends beyond the classical mutational resistance mechanisms. Among the new chromosomic resistance determinants encountered, mutations within the penicillin-binding-protein 3 (PBP3), shaping up beta-lactam resistance, are noteworthy as well as mutations within the fusA1 gene, coding for elongation factor G, which along with MexXY overexpresion contribute to high-level aminoglycoside resistance. Strikingly, we encountered that MexXY overexpression is dispensable for in vitro resistance development to aminoglycosides which suggests an evolutionary advantage of its overexpression in the CF respiratory tract. Altogether this work demonstrates that clonal epidemiology and antibiotic resistance evolution in the CF setting results from the complex interplay among mutation-driven resistance mechanisms, within host diversification and interpatient transmission of epidemic strains.[spa] La infección respiratoria crónica por P. aeruginosa es la principal causa de morbilidad y mortalidad en pacientes con fibrosis quística (FQ). Durante la progresión desde la infección temprana a la colonización crónica, P. aeruginosa experimenta un complejo proceso adaptativo y de diversificación que resulta en una población heterogénea y persistente en la que la aparición de resistencias a los antibióticos comprometen la selección de terapias apropiadas. En este trabajo se investigó la interacción entre tres aspectos microbiológicos clave de estas infecciones: la presencia de cepas transmisibles y persistentes, la aparición de variantes con tasas de mutación incrementadas y la evolución de la resistencia a los antibióticos. La epidemiología clonal, los perfiles de sensibilidad antibiótica, la contribución de los mecanismos clásicos de resistencia de P. aeruginosa y el papel de las variantes hipermutadoras se estudiaron en dos grandes colecciones de aislados procedentes de pacientes con fibrosis quística de las Islas Baleares y España. Asimismo, mediante secuenciación de genoma completo, se determinó la filogenia, diseminación interpaciente, evolución intrapaciente, genotipo hipermutador y resistoma de una colección de aislados clonales pertenecientes al complejo clonal 274 (CC274), proviniendo dichos aislados de dos países muy distantes, Australia y España, y cubriendo un período de 18 años. Finalmente, dada la relevancia de los aminoglucósidos en el manejo de estos pacientes, se estudió la dinámica del desarrollo de resistencia a aminoglucósidos in vitro mediante secuenciación de genoma completo. A pesar de encontrarse discrepancias entre los métodos de genotipado molecular, se documentó un alto grado de diversidad genética en las colecciones de las Islas Baleares y España, siendo escasa la representación de cepas epidémicas. No obstante, por primera vez en España, se documentó un caso de sobreinfección con el clon epidémico multirresistente de Liverpool. Además, en 5 pacientes de Baleares, crónicamente colonizados y sin aparente relación epidemiológica, se detectó el CC274. Puesto que este complejo clonal también ha sido detectado en pacientes de países como Austria, Australia y Francia, éste debería incluirse en la creciente lista de cepas epidémicas. El análisis posterior de las secuencias de genoma completo de los aislados del CC274 evidenció la diseminación interpaciente de un sublinaje hipermutador, denotando además el potencial de estas variantes para la inesperada evolución a corto plazo del secuenciotipo y la rápida diseminación de resistencias. Además, los estudios epidemiológicos demostraron la coexistencia de dos linajes divergentes, no evidenciándose barrera geográfica. Asimismo se documentó una tendencia generalizada a la acumulación de resistencias a los antibióticos en el tiempo, acompañada de hipersensibilidad a ciertos antibióticos como aztreonam, lo cual se puede explicar en términos de sensibilidad colateral. La correlación entre los fenotipos y genotipos determinados mediante secuenciación del genoma completo de los aislados pertenecientes al CC274 nos permitió definir el resistoma mutacional de P. aeruginosa en la FQ, el cual se extiende más allá de los mecanismos mutacionales clásicos. Entre los nuevos determinantes de resistencia cromosómica encontrados caben destacar tanto las mutaciones en la proteína fijadora de penicilina PBP3, que confieren resistencia a betalactámicos, como las mutaciones en fusA1, que codifica para el factor de elongación G, y que junto con la hiperexpresión de MexXY contribuyen a la resistencia de alto nivel a aminoglucósidos. Paradójicamente, encontramos que la hiperexpresión de MexXY es prescindible para el desarrollo de resistencia in vitro a aminoglucósidos, lo que sugiere que dicha hiperexpresión confiere una ventaja evolutiva in vivo. En conjunto, este trabajo demuestra que, en la FQ, la epidemiología clonal y la evolución de la resistencia a los antibióticos son el resultado de una compleja interacción entre los mecanismos de resistencia mutacionales, la diversificación de la población infectante y la transmisión interpaciente de cepas epidémicas.[cat] La infecció respiratòria crònica per P. aeruginosa és la principal causa de morbiditat i mortalitat en els pacients amb fibrosi quística (FQ). Durant la progressió des de la infecció primerenca a la colonització crònica, P. aeruginosa experimenta un complexe procés adaptatiu i de diversificació que resulta en una població heterogènia i persistent en la qual l'aparició de variants resistents a múltiples antibiòtics comprometen la selecció de teràpies antibiòtiques apropiades. En aquest treball es va investigar la interacció entre tres aspectes microbiològics clau: la presència de soques transmissibles i persistents, l'aparició de variants amb taxes de mutació incrementades i l'evolució de la resistència als antibiòtics. L'epidemiologia clonal, els perfils de sensibilitat antibiòtica, la contribució dels mecanismes clàssics de resistència i el paper de les variants hipermutadores es van estudiar en dos grans col·leccions d'aïllats procedents de pacients amb FQ de les Illes Balears i Espanya. Així mateix, mitjançant seqüenciació del genoma complet, es va determinar la filogènia, disseminació interpacient, evolució intrapacient, genotip hipermutador i resistoma d'una col·lecció d'aïllats pertanyents al complexe clonal 274 (CC274), provenint de dos països molt distants, Austràlia i Espanya, i cobrint un període de 18 anys. Finalment, donada la rellevància dels aminoglicòsids en el maneig d’aquests pacients, es va estudiar la dinàmica del desenvolupament de resistència a aminoglicòsids in vitro mitjançant seqüenciació de genoma complet. Tot i trobar discrepàncies entre els mètodes de genotipat molecular, es va documentar un alt grau de diversitat genètica en les col·leccions de les Illes Balears i Espanya, sent escassa la representació de soques epidèmiques. No obstant això, per primera vegada a Espanya, es va documentar un cas de sobreinfecció amb el clon epidèmic multiresistent de Liverpool. A més, en 5 pacients de les Illes Balears, crònicament colonitzats i sense aparent relació epidemiològica, es va detectar el CC274. Ja que aquest complexe clonal també ha estat detectat en països com Àustria, Austràlia i França, aquest clon hauria d'incloure a la creixent llista de soques epidèmiques. L'anàlisi posterior de les seqüències de genoma complet dels aïllats pertanyents al CC274, va evidenciar la disseminació interpaciente d'un subllinatge hipermutador, denotant a més el potencial d'aquestes variants per a la inesperada evolució a curt termini del sequenciotip i per a la ràpida disseminació de la resistència antibiòtica. A més, els estudis epidemiològics van demostrar la coexistència de dos llinatges divergents, no existint barrera geogràfica. Així mateix es va evidenciar una tendència generalitzada a l'acumulació de resistències en el temps, acompanyada d'hipersensibilitat a certs antibiòtics com l’aztreonam, la qual cosa es pot explicar en termes de sensibilitat col·lateral. La correlació entre els fenotips i genotips determinats mitjançant seqüenciació del genoma complet dels aïllats pertanyents al CC274 ens va permetre definir el resistoma mutacional de P. aeruginosa en la FQ, el qual s'estén més enllà dels mecanismes de resistència mutacionals clàssics. Entre els nous determinants de resistència cromosòmica trobats cal destacar tant les mutacions en la proteïna fixadora de penicil·lina PBP3, que confereixen resistència a betalactàmics, així com les mutacions en fusA1, que codifica per al factor d'elongació G, i que juntament amb la hiperexpressió de MexXY contribueixen a la resistència d'alt nivell a aminoglucòsids. Paradoxalment, vam trobar a més que la hiperexpressió de MexXY és prescindible per al desenvolupament de resistència in vitro a aminoglucòsids, el que suggereix que aquesta hiperexpressió suposa un avantatge evolutiu in vivo. En conjunt, aquest treball demostra que l'epidemiologia clonal i l'evolució de la resistència als antibiòtics en el context de la FQ són el resultat d'una complexa interacció entre els mecanismes de resistència mutacionals, la diversificació de la població infectant i la transmissió interpaciente de ceps epidèmiques