Ex vivo and in vitro studies on Toll like receptors in canine Leishmania infection

La leishmaniosis canina (CanL) es una enfermedad causada por el protozoa Leishmania infantum. Las manifestaciones clínicas en el perro son muy variables, abarcan desde una infección subclínica a un cuadro severo, que puede ser fatal. Al ser una enfermedad compleja, es difícil de diagnosticar. La respuesta inmunitaria de cada individuo juega un papel muy importante, tanto para el diagnóstico como para su tratamiento. Los receptores tipo Toll (TLRs) son los principales iniciadores de la respuesta inmunitaria innata cuya función es frenar cualquier intrusión de agentes extraños al cuerpo. Sin embargo, poca información existe sobre el papel de estos receptores en la CanL. El objetivo general de esta tesis doctoral es investigar el papel que los TLRs tiene en la CanL, tanto en experimentos ex vivo como in vitro. En la presente tesis doctoral, se ha estudiado la expresión genética en sangre no estimulada de los TLR2 y TLR4, en el momento del diagnóstico y durante el tratamiento, demostrando un notable aumento de la transcripción del TLR2 en perros con leishmaniosis clinica. Cuando se compararon perros enfermos en diferentes estadíos clínicos, se observó una expresión más notoria del TLR2 en aquellos perros que padecían la enfermedad de forma más severa comparado con los perros con estadíos más leves o con dermatitis papular. En, estos últimos, se notó de forma característica que tenían una alta producción de la citoquina interferon-gamma (IFN-γ). En sangre estimulada con antígeno soluble de Leishmania (LSA), la expresión del TLR2 y TLR4 disminuye en los perros enfermos que son productores de IFN-γ. Estimulando la sangre con TLRs agonistas, se halló un aumento en la producción de las citoquinas IFN-γ, TNF-α y IL-6 particularmente después de la estimulación con los agonistas TLR4 y TLR7 en sangre de perros naturalmente infectados. En el estudio in vitro incluido en esta tesis doctoral, en el cual macrófagos caninos fueron infectados experimentalmente con L. infantum y tratados con diferentes fármacos convencionales y TLRs agonistas, solos o combinados entre ellos, se demostró que la tasa de infección y la intensidad de infección se redujeron después de la estimulación los agonistas de TLRs. Además, el agonista TLR4 parece tener un efecto sinérgico combinado con el alopurinol. Así pues, con estos resultados, se ha ampliado el conocimiento de los TLRs en la infección por L. infantum en el perro. Y se han obtenido resultados esperanzadores para seguir investigando en esta línea sobre cómo los TLRs agonistas podrían actuar como inmunomoduladores en el tratamiento de esta enfermedad o incluso como adyuvantes en vacunas.La leishmaniosi canina (CanL) és una malaltia zoonòtica causada pel paràsit Leishmania infantum, de distribució mundial i altament endèmica a la conca mediterrània. Aquest paràsit es transmet mitjançant la picada de les femelles de flebòtoms, sent el gos l'hoste i reservori principal. Les manifestacions clíniques de la infecció per L. infantum en el gos són molt variables, des d'una infecció subclínica crònica fins a una malaltia molt severa, que pot ser fatal. Deguda a la seva complexa patogènesi, és important el paper que juguen tant la resposta immunitària innata i adaptativa en aquesta infecció. No obstant això, hi ha més informació al gos sobre la resposta immunitària adaptativa que sobre la innata. Els receptors tipus Toll (TLRs) són primordials en la maquinària del sistema immunitari innat que faciliten la ràpida detenció de diverses infeccions així com l'activació de la cascada inflamatòria. No obstant això, el paper d'aquests receptors en la infecció per L. infantum en gossos no és molt coneguda i la informació que hi ha sobre els mateixos és molt limitada. La hipòtesi d'aquesta tesi doctoral és que els TLRs tenen un paper important en la infecció per L. infantum pel fet que estimulen la cascada inflamatòria. L'objectiu general de la present tesi doctoral va ser el d'investigar l'expressió de TLRs en la CanL comparant amb paràmetres parasitològics, clínics, bioquímics i immunològics així com avaluar el possible ús dels agonistes de TLRs en el tractament d'aquesta malaltia. Els objectius específics s'han desenvolupat en 5 estudis que es descriuen a continuació. El primer objectiu específic es descriu en el capítol 3.1. i va consistir en avaluar l'expressió dels receptors tipus Toll 2 (TLR2) i 4 (TLR4) en sang no estimulada de gossos amb leishmaniosi clínica moderada en el moment del diagnòstic i durant un any de tractament així com correlacionar els paràmetres clínics, bioquímics i parasitològics. En el capítol 3.2., es descriu el segon experiment on es va avaluar la quantificació relativa de l'TLR2 i TLR4 en gossos infectats per L. infantum en diferents estadis de la malaltia segons la classificació de LeishVet en el moment del diagnòstic. L'estudi va consistir a determinar a més els anticossos i la producció d'interferó gamma (IFN-γ) específiques enfront del paràsit així com la parasitèmia en estadi clínic I (gossos amb dermatitis papular) i en estadis clínics II-III (gossos amb dermatitis exfoliativa o ulcerativa). L'objectiu específic del tercer estudi (capítol 3.3.) Va ser el de determinar la transcripció dels gens TLR2, TLR4 i el lligant 1 de mort programada (PD-L1) en sang estimulada amb antigen soluble de L. infantum (LSA) i el mitogen Concanavalina a (Con A) en gossos malalts capaços de produïr IFN-γ i els no capaços i en gossos sans. El propòsit de l'estudi ex vivo 3.4. va ser determinar la producció de les citocines IFN-γ, TNF-α i IL-6 en sang estimulada amb LSA o agonistes TLRs (TLRsa) com el TLR3a, TLR4a i TLR7a sols o amb combinació de LSA i cadascun dels TLRa en gossos sans infectats naturalment per Leishmània. Finalment es va realitzar un experiment in vitro (estudi 3.5) on es va avaluar la susceptibilitat del paràsit a diferents fàrmacs convencionals anti-Leishmània (al·lopurinol, miltefosine o meglumine antimoniat) tan en promastigots com en amastigots en una línia cel·lular de macròfags canins així com amb el tractament dels agonistes de TLR2, 3, 4 i 7 sols o combinats amb els fàrmacs convencionals. Els estudis descriptius d'aquesta tesi han confirmat que els TLRs semblen tenir un paper en la malaltia. Els gossos infectats amb Leishmània malalts presenten diferent expressió dels TLRs comparat amb els individus sans, depenent directament també del perfil immunològic de l'animal i de l'estadi clínic. Així doncs, en aquesta tesi doctoral, es va observar la sobreexpressió del TLR2 en sang no estimulada en el moment del diagnòstic en gossos amb malaltia moderada (estadi II-III) en comparar amb els gossos sans. No obstant això, l'expressió de TLR2 en sang no estimulada va ser igual per als gossos amb malaltia lleu (estadi I) i els gossos sans. A més, es va produir una disminució de l'expressió del TLR2 durant un any de tractament i la millora clínica en els gossos amb malaltia moderada. No obstant això, no es van observar canvis en l'expressió de TLR4 en el diagnòstic ni durant el tractament en cap dels gossos estudiats. És important assenyalar també que l'expressió de TLR2 es va correlacionar amb paràmetres clínics, parasitològics i immunològics associats a malaltia de moderada a severa. A més, els gossos amb estadi lleu I i amb dermatitis papular tenien un perfil immunològic predominant Th1, en canvi, els animals classificats en estadis més severs predominava un perfil Th2. Els resultats obtinguts en sang estimulada amb LSA van ser molt interessants i correlacionats amb les troballes obtingudes en sang no estimulada. Es va observar una reducció en l'expressió gènica dels gens TLR2 i TLR4 en sang estimulada amb LSA en els gossos malalts que eren productors de IFN-γ comparat amb els gossos sans i una alta expressió de PD-L1 a tots els grups estudiats tant per LSA com per amb Con A. La sang estimulada amb TLRsa en gossos sans va resultar tenir una alta producció de les citoquines TNF-α i IL-6, comparades amb el medi sol. A més, es va observar un efecte sinèrgic pro-inflamatori quan es va estimular amb TLR4a i TLR7a en combinació amb LSA. En els estudis in vitro es va demostrar la susceptibilitat del paràsit als fàrmacs convencionals sent el fàrmac més eficaç la miltefosina. A més, es va demostrar que els TLRs agonistes sols redueixen la infecció i es va observar també sinergia en la reducció de la infecció amb al·lopurinol i els agonistes per al TLR4. No obstant això, no es va detectar la producció de TNF-α ni de NO en els sobrenedants recollits a les 72 hores. No obstant això, sí que es va detectar la transcripció dels TLR2, 4 i 7 en totes les condicions estudiades. En general, es va demostrar una disminució de la transcripció de TLR2 o sense canvis en l'expressió de TLR4 i TLR7 amb la infecció . No obstant això, l'expressió de TLRs després del tractament amb fàrmacs anti-Leishmania convencionals sols o els agonistes de TLRs sols o combinacions dels dos va ser més variable. En conclusió, aquesta tesi doctoral ha demostrat que l'expressió de TLR2 en sang no estimulada és un marcador de malaltia de moderada a severa. No obstant això, el TLR4 no sembla ser un bon marcador per CanL en sang no estimulada. A més, la reducció de l'expressió dels TLR2 i 4 en sang estimulada amb LSA es va associar a gossos malalts productors d’IFN-γ els quals tenen un perfil més protector que gossos no productors d’IFN-γ. L'experiment in vitro ens va revelar que els fàrmacs combinats amb els TLRsa o fins i tot els TLRsa sols poden reduir la infecció. Per aquest motiu, els resultats trobats en aquesta tesi suggereixen que els TLRs podrien utilitzar-se com immunoteràpia, sols o combinats amb fàrmacs convencionals.Canine leishmaniosis (CanL) is a zoonotic disease caused by the protozoan Leishmania infantum, of worldwide distribution and highly endemic in the Mediterranean basin. This parasite is transmitted by the bite of sandfly females. The dog is the main host and reservoir. The clinical manifestations of L. infantum infection in the dog are very variable and range from a chronic subclinical infection to a very severe disease, which can be fatal. Due to its wide pathogenesis, the innate and adaptive immune responses play a role in this canine infection. However, there is much more information on the adaptive immune response than on the innate one. Toll-like receptors (TLR) are essential in the machinery of the immune system that facilitates the early arrest of several infections as well as the activation of the inflammatory cascade. However, the role of these receptors in L. infantum infection in dogs is not well known and the information is very limited. The hypothesis of this doctoral thesis is that TLRs have an important role in L. infantum infection in dogs because they stimulate the inflammatory cascade. The general objective of this doctoral thesis was to investigate the expression of TLRs in the CanL and compare with parasitological, clinical, biochemical and immunological parameters as well as to evaluate the possible use of TLR agonists in the treatment of this disease. The specific objectives have been developed in five studies and are described below. The first specific objective is described in chapter 3.1. and consisted in evaluating the expression of Toll-like receptors 2 (TLR2) and 4 (TLR4) in unstimulated blood of dogs with moderate clinical leishmaniosis at the time of diagnosis and during one year of treatment as well as correlating clinical, biochemical and parasitological parameters. In chapter 3.2., we described the second experiment where the relative quantification of TLR2 and TLR4 was evaluated in dogs infected by L. infantum in different stages of the disease according to the LeishVet classification at the time of diagnosis. This study also investigated the antibodies and the production of interferon gamma (IFN-γ) specific to the parasite as well as the parasitemia in clinical stage I (dogs with papular dermatitis) and in clinical stages II-III (dogs with exfoliative dermatitis or ulcerative) The specific objective of the third study (Chapter 3.3.) was to determine the transcription of the TLR2, TLR4 and programmed death ligand 1 (PD-L1) genes in blood stimulated with L. infantum soluble antigen (LSA) and the mitogen Concanavalin A (Con A) in sick dogs IFN-γ producers and non-IFN-γ producers and healthy dogs. The purpose of the study described in chapter 3.4. was to determine the production of the cytokines TNF-α and IL-6 in blood stimulated with LSA or TLRs agonists (TLR3, TLR4 and TLR7) alone or combined of dogs naturally infected by Leishmania. Finally, an in vitro experiment (Chapter 3.5) was carried out where the parasites’ susceptibility to different conventional anti-Leishmania drugs (allopurinol, miltefosine or meglumine antimonate) was evaluated in promastigote and amastigote assays in a canine macrophage cell line as well as in the treatment of TLRs agonists 2, 3, 4 and 7 (TLRsa) alone or in combination with conventional drugs. Descriptive studies of this thesis have confirmed that TLRs seem to have a role in the disease. Sick dogs infected with Leishmania present different expression of TLRs compared to healthy individuals, also directly depending on the immunological profile of the animal as well as the clinical stage. Thus, in this doctoral thesis, overexpression of TLR2 was obtained in unstimulated blood at the time of diagnosis in dogs with moderate disease (stage II-III) when compared with healthy dogs. However, expression of TLR2 in unstimulated blood was the same for dogs with mild disease (stage I) and healthy dogs. In addition, there was a decrease in the expression of TLR2 during one year of treatment and clinical improvement in dogs with moderate disease. However, no changes were observed in TLR4 expression at diagnosis or during treatment in any of the dogs studied. It is also important to highlight that the expression of TLR2 was correlated with clinical, parasitological and immunological parameters associated with moderate to severe disease. In addition, dogs with mild stage I and papular dermatitis had a predominantly Th1 immunological profile whereas animals classified in more severe stages had a Th2 profile predominant. The results obtained in blood stimulated with LSA were very interesting and correlated with the findings obtained in unstimulated blood. A reduction in gene expression of the TLR2 and TLR4 genes in blood stimulated with LSA was observed in sick dogs that were IFN-γ producers compared to healthy dogs and a high expression of PD-L1 in all the groups studied for both LSA as for Con A. The blood stimulated with TLRs agonists (TLRsa) and LSA of sick dogs turned out to have a high production of the cytokines IFN-γ, TNF-α and IL-6, compared with the medium alone. The combinations that gave the most production of cytokines of the Th1 profile are the agonists TLR4 and TLR7 each combined with LSA. In vitro studies demonstrated the susceptibility of the parasite to conventional drugs, being miltefosine the most effective drug. In addition, it was shown that TLRsa agonists alone reduced infection, and a synergistic effect was also observed in the reduction of infection with allopurinol and agonists for TLR4. However, the production of TNF-α or NO was not detected in the supernatants collected after 72 hours. However, the transcription of TLR2, 4 and 7 was detected in all the conditions studied. In general, a decrease in the transcription of TLR2s was demonstrated or no changes in the expression of TLR4 and TLR7 with infection. However, the expression of TLRs after treatment with conventional anti-Leishmania drugs alone or TLR agonists alone or combination of both was more variable. In conclusion, this doctoral thesis has shown that the expression of TLR2 in blood is not stimulated in a marker of moderate to severe disease. However, TLR4 does not appear to be a good marker for CanL in unstimulated blood. In addition, the reduced expression of TLR2 and 4 in blood stimulated with LSA was associated with sick dogs responding to IFN-γ which have a more protective profile than dogs not responding to IFN-γ. The in vitro study revealed that drugs combined with TLRsa or even TLRsa alone can reduce infection. For this reason, the findings found in this thesis are that TLRs can be used as immunotherapy or as adjuvants in future vaccines