Metabolic engineering and genome editing in rice

El meu programa d’investigació s’ha basat en la utilització de l’arròs com a model experimental per a estudiar mecanismes i colls d’ampolla que limiten la transició de l’enginyeria metabòlica a la biologia sintètica en les plantes. Em vaig concentrar en la caracterització a nivell molecular i bioquímica de plantes que vaig generar en dos conjunts de línies d’investigació diferents però interrelacionades. En el primer conjunt d’experiments vaig abordar la hipòtesi que en eliminar gens específics en una ruta metabòlica primària, concretament la biosíntesi de midó, les plantes mutants resultants podrien mostrar fenotips propicis per a aplicacions de biologia sintètica en termes de redireccionar el flux i limitar els precursors biosintètics a vies metabòliques secundàries específiques. En aquest context, vaig utilitzar CRISPR/Cas9 per crear dos mutants heterozigots, un amb una glucosa-1-fosfat adenil transferasa (AGPasa) citosòlica severament truncada i no funcional i l’altre amb una modificació estructural C-terminal causant una pèrdua parcial d’activitat. Inesperadament, vaig observar una reducció del midó en les fulles de tots dos mutants i un augment concomitant en el nivell de sucres solubles. Això es va reflectir en l’expressió no prevista d'OsAPL2 i OsAPS2b en les fulles, generant una AGPasa ectòpica completa en el citosol de la fulla, i una disminució en l’expressió de la subunitat petita plastidial OsAPS2a que es va complementar només parcialment amb un augment en l’expressió de OsAPS1 En un conjunt posterior d’experiments amb base similar, vaig investigar els efectes més amplis de les mutacions en un gen de la biosíntesi de midó, la midó sintasa unida a grànuls (GBBS, waxy). Vaig utilitzar CRISPR / Cas9 per introduir un rang de mutacions amb diferents efectes en aquest gen específic. Vaig trobar que les mutacions produïdes van reduir, però no van abolir totalment, l’activitat de GBSS en les llavors a causa d’una compensació parcial causada per la regulació ectòpica de GBSSII. L’activitat de GBSS en els mutants va ser de 61 a 71% dels nivells dels controls, però el contingut d'amilosa, va disminuir del 8 al 12% en llavors heterozigotes i va ser tan baix com nomes un 5% en llavors homozigotes, acompanyat per una organització cel•lular anormal en la capa d'aleurona i amb estructures del gra de midó amorfes. Gairebé tots els gens de la via del midó es van veure afectats a diferents nivells en les fulles i llavors. Aquests canvis en l’expressió gènica van donar com a resultat canvis en l’activitat de la AGPasa i de la sacarosa sintasa que coincidien amb els nivells corresponents de midó i sucres solubles. La segona línia del meu programa d’investigació es va centrar en l’enginyeria d'una via ectòpica de MVA en plastidis d’arròs per investigar la hipòtesi que al reconstituir la via ectòpica, la regulació estricta de la via de MVA nativa podria relaxar-se en cert grau a mesura que augmentés el conjunt de precursors terpenoides essencials. Els resultats van indicar un augment molt elevat dels nivells d’àcids grassos, luteïna i tocoferol, i una reducció en els nivells d'esqualè i d’esterols. Els meus resultats són el fonament per a futurs experiments encaminats a determinar si el germoplasma que he creat i caracteritzat pot servir de base per a intervencions d’enginyeria metabòlica i biologia sintètica més complexes.Mi programa de investigación se ha basado en la utilización del arroz como modelo experimental para estudiar mecanismos y cuellos de botella que limitan la transición de la ingeniería metabólica a la biología sintética en las plantas. Me concentré en la caracterización a nivel molecular y bioquímica de plantas que generé en dos conjuntos de líneas de investigación distintas pero interrelacionadas. En el primer conjunto de experimentos abordé la hipótesis de que al eliminar genes específicos en una ruta metabólica primaria, concretamente la biosíntesis de almidón, las plantas mutantes resultantes podrían mostrar fenotipos propicios para aplicaciones de biología sintética en términos de redireccionar el flujo y limitar los precursores biosintéticos a vías metabólicas secundarias específicas. En este contexto, utilicé CRISPR/Cas9 para crear dos mutantes heterocigotos, uno con una glucosa-1-fosfato adenil transferasa (AGPasa) citosólica severamente truncada y no funcional y el otro con una modificación estructural C-terminal causando una pérdida parcial de actividad. Inesperadamente, observamos una reducción del almidón en las hojas de ambos mutantes y un aumento concomitante en el nivel de azúcares solubles. Esto reflejó la expresión no prevista de OsAPL2 y OsAPS2b en las hojas, generando una AGPasa ectópica completa en el citosol de la hoja, y una disminución en la expresión de la subunidad pequeña plastidial OsAPS2a que se complementó solo parcialmente con un aumento en la expresión de OsAPS1 En un conjunto posterior de experimentos, con similar base, investigué los efectos más amplios de las mutaciones en un gen de la biosintésis de almidón, la almidon sintasa unida a gránulos (GBBS, waxy). Utilicé CRISPR/Cas9 para introducir un rango de mutaciones con diferentes efectos en este gen específico. Encontre que las mutaciones producidas redujeron, pero no abolieron la actividad de GBSS en las semillas, debido a una compensación parcial causada por la regulación ectópica de GBSSII. La actividad de GBSS en los mutantes fue de 61 a 71% de los niveles de los controles, pero el contenido de amilosa, sin embargo, disminuyó a 8 a 12% en semillas heterocigotas y fue tan bajo como 5% en semillas homocigotas, acompañado por una organización celular anormal en la capa de aleurona y con estructuras del grano de almidón amorfas. Casi todos los genes de la vía del almidón se vieron afectados a diferentes niveles en las hojas y semillas. Estos cambios en la expresión génica dieron como resultado cambios en la actividad de la AGPasa y de la sacarosa sintasa que coincidían con las alteraciones en los niveles de almidón y azúcares solubles. La segunda línea de mi programa de investigación se centró en la ingeniería de una vía ectópica de MVA en plastidios de arroz para investigar la hipótesis de que al reconstituir la vía ectópica, la regulación estricta de la vía de MVA nativa podría relajarse en cierto grado a medida que aumentase el conjunto de precursores terpenoides esenciales. Los resultados indicaron un aumento en los niveles de ácidos grasos, luteína y tocoferol, una reducción en los niveles de escualeno y niveles similares de esteroles. Mis resultados son el fundamento para futuros experimentos encaminados a determinar si el germoplasma que he creado y caracterizado puede servir de base para intervenciones de ingeniería metabólica y biología sintética más complejas.My research program used rice as an experimental model to address fundamental bottlenecks and mechanisms limiting the transition from metabolic engineering to synthetic biology in plants. I concentrated on an in depth molecular and biochemical characterization of plants I generated in two distinct, yet interrelated sets of research lines. In the first set of experiments I addressed the hypothesis that by knocking out specific genes in a primary metabolic pathway, starch biosynthesis, resulting mutant plants might exhibit phenotypes conducive to synthetic biology applications in terms of redirecting flux and limiting biosynthetic precursors to specific secondary metabolic pathways. In this context I used CRISPR/Cas9 to create two heterozygous mutants, one with a severely truncated and non-functional cytosolic glucose-1-phosphate adenylyl transferase (AGPase) and the other with a C-terminal structural modification causing a partial loss of activity. Unexpectedly, both mutants exhibited depletion of starch in the leaves and a corresponding increase in the level of soluble sugars. This reflected the unanticipated expression of both OsAPL2 and OsAPS2b in the leaves, generating a complete ectopic AGPase in the leaf cytosol, and a corresponding decrease in the expression of the plastidial small subunit OsAPS2a that was only partially complemented by an increase in the expression of OsAPS1. In a subsequent set of experiments along similar lines I investigated the broader effects of mutations in an additional starch biosynthetic gene, granule bound starch synthase (GBBS, waxy). I used CRISPR/Cas9 to introduce a range of mutations with different effects in this specific gene. All mutations I recovered reduced but did not abolish GBSS activity in seeds due to partial compensation caused by the ectopic upregulation of GBSSII. The GBSS activity in the mutants was 61–71% of wild-type levels, but the amylose content nevertheless declined to 8–12% in heterozygous seeds and to as low as 5% in homozygous seeds, accompanied by abnormal cellular organization in the aleurone layer and amorphous starch grain structures. Almost every starch pathway gene was impacted at different degrees in leaves and seeds. These gene expression changes resulted in changes in AGPase and sucrose synthase activity that explained the corresponding levels of starch and soluble sugars. The second line of my program focused on the engineering of an ectopic MVA pathway in rice plastids in order to investigate the hypothesis that by reconstituting such an ectopic pathway the strict regulation of the native MVA pathway might be relieved to a certain degree in turns increasing the pool of essential terpenoid precursors. Results indicated a profound increase in the levels of fatty acids, lutein and tocopherol, a decrease in squalene levels and similar levels of sterols. My results set the stage for further experiments to ascertain whether germplasm I created and characterized, can serve as a basis for more complex metabolic engineering and synthetic biology interventions