Understanding RanGTP dependent microtubule assembly : Idenification of DnaJB6 as a RanGTP regulated factor involved in microtubule organization during mitosis

Three microtubule (MT) assembly pathways participate in the assembly of the bipolar spindle: the centrosomal pathway, the augmin dependent amplification pathway and the RanGTP/chromosome dependent pathway. To form the spindle, all these MTs are organized by various classes of motor proteins into two interdigitating antiparallel arrays with their minus ends focused at the spindle poles. This focusing activity is provided by the minus-end directed motor proteins Dynein-Dynactin and HSET. Spindle assembly can occur in the absence of centrosomes indicating that the RanGTP and augmin dependent pathways are sufficient. The RanGTP pathway can be studied in Xenopus laevis egg extracts. Addition of RanGTP to these extracts triggers a dynamic process of MT nucleation, stabilization and organization into asters and mini spindles. To obtain a global picture of the RanGTP pathway we used a proteomics approach and determined the interactome of the RanGTP-MTs that consists of 1263 proteins. Moreover we have analyzed the changes in this proteome to try to correlate them with the change in MT dynamic and organization observed upon different time of incubation of the egg extract with RanGTP. Although the composition of the proteome did not change, we found different patterns of recruitment for various protein groups. The proteome includes most of the known RanGTP regulated factors in mitosis and significantly overlaps with previously published spindle and taxol-MT proteomes. In addition it contains a large number of other proteins with described or undescribed functions in various cellular processes. We used this proteome to identify novel putative RanGTP regulated spindle assembly factors (SAFs). We identified DnaJB6 as a RanGTP regulated protein involved in spindle assembly. We found that it interacts with dynactin p150 in a RanGTP dependent manner specifically in M-phase. We show that DnaJB6 favors the stabilization of the Dynactin complex specifically in mitosis, regulating the activity of Dynein-Dynactin complex in bipolar spindle assembly and MT focusing at the spindle poles.Tres vies de formació de microtúbuls (MT) participen en la formació del fus mitòtic: la centrosòmica, la via d’amplificació dependent d’Augmin i la via dependent de RanGTP o cromosòmica. Per formar el fus, tots aquests MTs són organitzats per diferents classes de proteïnes motores en dos feixos interconnectats de MTs antiparal·lels, amb els seus extrems negatius concentrats al pols del fus. Dynein-Dynactin i HSET s’encarreguen de concentrar els extrems negatius als pols. El fus es pot formar també en absència de centrosomes, indicant que les vies de RanGTP i d’Augmin són suficients per formar-lo. La via de RanGTP es pot estudiar utilitzant extractes d’ous (EE) de Xenopus Laevis. L’addició de RanGTP activa un procés dinàmics de nucleació, estabilització i organització del MTs en asters i mini-fusos. Hem utilitzat la proteòmica com una aproximació per obtenir una visió global de la ruta de RanGTP i em descrit un interactoma dels RanGTP-MTs de 1263 proteïnes. A més, hem analitzat els canvis en aquest proteoma intentant correlacionar-los amb canvis en la dinàmica i l’organització observades al llarg de diferents temps d’incubació de l’EE amb RanGTP. Tot i que la composició del proteoma no varia, hem trobat diferents patrons de reclutament per varis grups de proteïnes. El proteoma inclou la majoria dels factors regulats per RanGTP en mitosis que es coneixen i te un elevat grau de solapament amb altres proteomes del fus i dels Taxol-MTs publicats prèviament. A més, conté un elevat nombre de proteïnes amb i sense roles descrits en varis processos cel·lulars. Hem utilitzat el proteoma dels RanGTP-MTs per identificar nous possibles factors regulats per Ran involucrats en la formació del fus. Hem identificat DnaJB6 com una proteïna regulada per Ran amb una funció en la formació del fus mitòtic. Hem descrit la interacció de DnaJB6 amb p150, dependent de RanGTP específicament en fase M. DnaJB6 afavoreix l’estabilització el complex Dynactin específicament en mitosis, regulant l’activitat de Dynein-Dynactin en l’establiment de la bipolaritat del fus mitòtic i la concentració dels extrems (-) dels MTs als pols del fus mitòtic