Dissecting and deactivating inmunosuppressive signals in melanoma microenvironment

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica. Fecha de lectura: 22-02-2019Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 22-08-2020Cutaneous melanoma is the most lethal form of skin cancer, characterized by a high metastatic potential and a remarkable ability to evade immune surveillance. Immune-based therapies using Immune Checkpoint blockers (ICB; i.e anti-PD1/PD-L1, anti-CTLA4) are currently the most successful treatments for metastatic melanoma. Unfortunately, clinical responses to ICB remain limited and/or transient. Resistance to ICBs is often observed in patients with low immunogenic tumors (cold tumors), or lesions with high infiltration of immune suppressive cells, such as tumor-associated macrophages (TAMs), T regulatory cells (Tregs) and myeloid-derived suppressor cells (MDSCs). Mechanisms that favor the recruitment and modulation of these immunosuppressive cells, and importantly, how to deactivate them are pending questions with direct translational impact in the melanoma field. This Thesis project was set to (i) characterize mechanisms of resistance to ICB in melanoma, with particular emphasis on myeloid suppressive cells (TAMs and MDSC), and (ii) to screen for novel therapeutic agents able to rewire myeloid cells towards potent anti-tumor responses. To this end, proteomic and transcriptomic analyses were performed to identify novel melanoma-secreted factors involved in tumor metastasis and drug resistance. In particular, we focused on the heparin-binding factor MIDKINE (MDK), a tumor-secreted factor that promotes lymphangiogenesis and metastasis. Using a combination of in vivo and in vitro experiments, we can now conclude that MDK activates NF-κB in melanoma cells in an ALK-dependent manner, leading to an inflammatory secretory program that increases intratumoral recruitment of MDSCs and Tregs. Additionally, MDK-induced secretome was found to favor STAT3 phosphorylation in myeloid cells, promoting their immune suppressive polarization. By modulating MDK levels of expression, we have shown that MDK secretion prevents immunotherapy responses to ICB in vivo. Moreover, MDK expression correlated with poor response to immunotherapy in melanoma patients, evidencing the relevance of our results. In parallel, we have observed that dsRNA-based nanoparticles (BO-110) can reverse this immunosuppression by a combined action in melanoma cells and macrophages. Specifically, we demonstrated that BO-110 suppresses MDK expression in melanoma cells, in a Type I IFN dependent manner, and induces their immunogenic cell death. In macrophages, BO-110 induced a potent tumoricidal activation leading to tumor-specific immune responses. In refractory melanoma mouse models, BO-110 synergized with anti-PD-L1 immunotherapy in suppressing tumor growth. Overall, we have characterized new mechanisms of ICB resistance mediated by MDK; yet, we also found that dsRNA-based therapies are able to potentiate ICB responses, even in refractory tumors.El melanoma cutáneo es la forma más letal de cáncer de piel, ya que se caracteriza por tener un alto potencial metastásico y una notable capacidad para evadir el sistema inmunitario. La inmunoterapia usando inhibidores (ej. Anti-PD1/PD-L1, anti-CTLA4) de los “Puntos de Control Inmunitario” (ICB, por sus siglas en inglés) es actualmente la forma más exitosa de tratar el melanoma metastásico. Desafortunadamente, las respuestas clínicas a los ICB siguen siendo limitadas y/o transitorias. La resistencia a los ICB a menudo se observa en pacientes con tumores poco inmunogénicos (tumores fríos) o con alta infiltración de células inmunosupresoras, como macrófagos tumorales (TAMs), células T reguladoras (Tregs) y células mieloides supresoras (MDSCs). Los mecanismos que favorecen el reclutamiento y la modulación de estas células inmunosupresoras -y cómo inactivarlas- son aún interrogantes con un gran impacto clínico para el melanoma. Los objetivos principales de esta Tesis fueron: (i) caracterizar los mecanismos de resistencia a ICB en el melanoma, fijando especial interés en células mieloides supresoras (TAM y MDSCs), e (ii) identificar nuevos agentes terapéuticos capaces de reconvertir las células mieloides en potentes células anti-tumorales. Con este fin, realizamos análisis proteómicos y transcriptómicos para identificar nuevos factores tumorales que pudieran estar implicados en la metástasis y la resistencia a los fármacos. En particular nos enfocamos en MIDKINA (MDK), un factor secretado por células tumorales que promueve la linfangiogénesis y la metástasis del melanoma. Hemos observado que MDK –vía el receptor ALK- activa la vía de NF-κB en células de melanoma, lo que induce un programa secretor pro-inflamatorio que aumenta el reclutamiento de MDSCs y Tregs. Además, observamos que el secretoma inducido por MDK favorece la fosforilación de STAT3 en células mieloides, lo cual promueve su actividad inmunosupresora. Modulando los niveles de expresión de MDK, hemos demostrado que su secreción previene la respuesta terapéutica a los ICB in vivo. Asimismo, hemos observado que los niveles de expresión de MDK correlacionan con una peor respuesta a la terapia anti-PD1 en pacientes con melanoma, lo que demuestra la relevancia de nuestros resultados. En paralelo, hemos observado que nano-partículas de ARN de doble cadena (BO-110) pueden revertir esta inmunosupresión mediante la acción combinada en células de melanoma y macrófagos. Específicamente, hemos demostrado que BO-110 suprime la secreción de MDK e induce una muerte celular inmunogénica en células de melanoma, mientras que en macrófagos promueve su potencial tumoricida, generando una potente inmunidad anti-tumoral. Además, hemos observado que BO-110 potencia la actividad terapéutica de los bloqueantes anti-PDL1 en modelos resistentes de melanoma de ratón. Por lo tanto, BO-110 representa una alternativa terapéutica muy eficiente. En resumen, hemos caracterizado nuevos mecanismos de resistencia a ICB mediados por la proteína MDK; y hemos demostrado que las terapias basadas en ARN de doble cadena son capaces de potenciar las respuestas a ICB, incluso en tumores refractarios.This work has been supported by the following fellowships and grants: - PhD international “la Caixa” Fellowships. 2012-2016. - RETOS Program. María S. Soengas. Spanish Ministry of Economy and Competitiveness. SAF2017-89533-R (2017-2018). - NANODENDMED II-CM. María S. Soengas. COMUNIDAD AUTONOMA DE MADRID. B2017/BMD-3703. 2012-2018. - Asociación Española Contra el Cáncer. María S. Soengas. AECC. 2016-2018