Identification and characterization of regulatory proteins involved in anthocyanin biosynthesis in Fragaria vesca and Rubus idaeus

Primary metabolites like carbohydrates, lipids, proteins, and nucleic acids, work as key components to sustain the plant. Besides those compounds, a wide array of so called ‘secondary metabolites’ are produced by the plant, which have been given much attention in the scientific literature due to their beneficial effect for the plant and the possible positive effect on human health. The number of identified plant secondary metabolites, exceeds 100.000 structures, which briefly can be classified as terpenoids, alkaloids, glucosides, sterols and, last but not least, phenylpropanoids. Fragaria vesca and Rubus idaeus; woodland strawberry and commercial raspberry, respectively, are two of the most popular berries on the market. The characteristic red coloration of their fruits is caused by the presence of anthocyanin pigments, secondary metabolites from the class of polyphenols. Those compounds are mainly produced during the late stages of fruit maturation and are essential phenotypic features; making plant breeders around the world consider these plant metabolites as a trait to follow up. The anthocyanin biosynthesis pathway is well studied in model plants. It is regulated at the transcriptional level by the well-known MBW complex. This complex is formed by the interaction of three different types of transcription factors (TFs): MYB, bHLH, and WD40, which have already been characterized in Arabidopsis thaliana, ornamental plants as Antirrhinum majus and Petunia hybrida, and even in some crops of major economic importance such as corn (Zea mays), soybean (Glycine max), and apple cultivars (Malus domestica). Nowadays, the level of complexity of the regulatory process of the anthocyanin biosynthesis pathway is becoming clear – one gene at a time. This regulation includes TFs, the promoter regions of the genes that are involved and the chromatin modifications necessary to carry out gene activation and consequent translation for the formation of each specific enzyme that will lead to the final anthocyanin formation inside the cells. The recent sequencing and annotation of the genomes of strawberry and raspberry as well as the possibility of transformation and the high amount of health-promoting anthocyanins present in the berries potentially make these plants great model systems to study the regulation of anthocyanin biosynthesis. This study aims to identify the role of bHLH proteins from raspberry and strawberry involved in anthocyanin biosynthesis. Based on the A. thaliana bHLH classification and phylogenetic studies reported, the genomes of F. vesca and R. idaeus were screened, and putative gene candidates were found for both species. Posterior sequence analyses based on protein primary structure and motif conservation were performed, and a total of 98 protein-coding sequences were found in F. vesca genome v1.0 and 90 sequences in the unreleased draft version of the R. idaeus genome. The in silico results obtained in chapter 3.1 provide three and two gene candidates for the woodland strawberry and raspberry, respectively: Fv3-FV2G25270, Fv33-FV7G08120, Fv145-FV5G02910, Ri3 gene36602 and Ri3- gene26116. After the identification of putative bHLH candidate genes, those genes were analyzed during fruit development and their function was studied in vitro and in vivo (chapter 4 and 5). The results of the study presented here forms the beginning of a possibility to breed new berry varieties with better traits, such as higher resistance to various stresses and a with a positive effect on the health of the consumer.Primärmetabolite wie Kohlenhydrate, Lipide, Proteine und Nukleinsäuren sind Schlüsselbestandteile der Pflanzen und notwendig für deren Entwicklung. Neben diesen Primärmetaboliten produzieren Pflanzen aber auch sogenannte sekundäre Pflanzenstoffe, die auch für das Leben der Menschen eine große Bedeutung haben, z.B. als Geruchs-und Geschmacksstoffe oder als Arzneistoffe. Die Vielfalt dieser Pflanzenstoffe wird in vielen essbaren Pflanzen erforscht und belangt sich derzeit auf mehr als 100.000 Stoffe. Diese Untersuchungen haben gezeigt, dass das Vorkommen dieser Stoffe nicht nur nützlich für die Entwicklung der Pflanzen ist, sondern auch, dass diese Stoffe einen positiven Einfluss auf die Gesundheit des Menschen haben können. Zu den sekundären Pflanzenstoffen zählen Terpenoide, Alkaloide, Glucosinolate, Sterole und Polyphenole. Fragaria vesca und Rubus idaeus, Wald-Erdbeere und Himbeere, sind zwei der beliebtesten Beerenfrüchte auf dem Weltmarkt. Die charakteristische rote Farbe der Früchte wird durch das Auftreten von Anthocyanpigmenten erzeugt, Sekundärmetabolite aus der Klasse der Polyphenole. Diese werden hauptsächlich während der Reifung der Beeren von der Pflanze produziert und Züchter weltweit benutzen das Vorkommen dieser Stoffe als typisches Merkmal in der Züchtung von Beerenfrüchten. Der Biosyntheseweg der Anthocyane ist sehr ausgiebig untersucht worden in Modellpflanzen. Die Regulation des Biosyntheseweges erfolgt auf dem Level der Transkription durch einen Komplex von Transkriptionsfaktoren, dem sogenannten MBW- oder MYB-bHLH-WD40-Komplex. Die Proteine dieses Komplexes und ihre Funktionen wurden in Arabidopsis thaliana untersucht, in den Zierpflanzen Antirrhinum majus und Petunia hybrida sowie in Feldfrüchten, die für uns Menschen von hoher wirtschaftlicher Bedeutung sind, wie Mais (Zea mays), Sojabohne (Glycine max) und Apfelsorten (Malus domestica). Die Vielschichtigkeit der Regulierung dieses Biosyntheseweges wird immer offensichtlicher mit jedem Gen, das genauer untersucht wird. Es ist bekannt, dass Transkriptionsfaktoren, die Promoter-Regionen von involvierten Biosynthese-Genen sowie die Modifikation des Chromatins durch Chromatin-verändernde Proteine bei der Bildung von Anthocyanen in der Zelle eine Rolle spielen. Die kürzlich erfolgte Sequenzierung und Genomannotation der Wald-Erdbeere und der Himbeere, die Möglichkeit der Transformation dieser Pflanzen sowie der extrem hohe Anteil an gesundheitsfördernden Anthocyanen in den Früchten, machen diese Pflanzen zu grossartigen Modell- Pflanzen, um die Regulierung des Anthocyan-Biosyntheseweges zu untersuchen. In der hier vorgelegten Studie wird das Ziel verfolgt, die Funktion der bHLH Proteine, die am Anthocyan- Biosyntheseweg beteiligt sind, zu identifizieren. Basierend auf der Einteilung der Arabidopsis bHLH Proteine und basierend auf veröffentlichten phylogenetischen Studien wurden die Genome beider Pflanzen gescreent und putative Gen- Kandidaten wurden identifiziert. Mit der erfolgten Sequenz-Analyse basierend auf der Primärstruktur der Proteine und basierend auf Motiven/Domänen in der Protein-Tertiärstruktur, wurden 98 Sequenzen im F. vesca Genom v1.0 und 90 Sequenzen in der unveröffentlichten Entwurfsversion des R. idaeus Genoms gefunden, die für bHLH Proteine kodieren. Im Kapitel 3.1 werden die in silico Ergebnisse vorgestellt. Es wurden drei Kandidaten-Gene in F. vesca und zwei Kandidaten-Gene in R. idaeus gefunden, die für mögliche bHLH Proteine kodieren, die im Biosyntheseweg der Anthocyane eine Rolle spielen; Fv3-FV2G25270, Fv33-FV7G08120, Fv145-FV5G02910, Ri3 gene36602 and Ri3-gene26116. Nach der Identifizierung der bHLH Kandidaten-Gene wurden diese in verschiedenen Entwicklungsstadien in Früchten analysiert und ihre Funktion in vitro und in vivo untersucht (Kapitel 4 und 5). Die Ergebnisse unserer Untersuchungen bilden den Anfang für die Möglichkeit der Züchtung neuer Erdbeer- oder Himbeersorten mit verbesserten Eigenschaften wie Stressresistenz und einem verbesserten Effekt auf die Gesundheit der Verbraucher