Biological and molecular studies approaches to Zucchini lethal chlorosis vírus (ZLCV) investigation, a differentiated species of the American group of Tospovirus

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2011.O gênero Tospovirus pertence à família Bunyaviridae que tem como espécie tipo Tomato spotted wilt virus (TSWV). Espécies deste gênero possuem grande relevância para as hortaliças, principalmente, para as culturas do tomate e do pimentão, nas quais causam perdas significativas. Além de TSWV, várias outras espécies de Tospovirus causam perdas de impacto na produção agrícola no País, como Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) que infecta abobrinha-da-moita, melancia e melão, Groundnut ringspot virus (GRSV) em tomate, pimentão e alface, Tomato chlorotic spot virus (TCSV) em tomate e pimentão, Chrysanthemum stem necrosis virus (CNSV) em plantas ornamentais e íris yellow spot virus (IYSV) em cebola. Estas espécies apresentam um espectro de hospedeiras de tamanho relevante. A doença tipo é chamada de "vira-cabeça" e está entre os principais problemas fitossanitários em variedades destes grupos de plantas. Em cucurbitáceas a doença é denominada de amarelo letal da abobrinha-da-moita. O Zucchini lethal chlorosis virus é uma espécie que foi descrita apenas no Brasil, principalmente nas regiões produtoras de cucurbitáceas dos Estados de São Paulo e de Tocantins, infectando, especialmente, abobrinha-da-moita,melão e melancia. Em relação às demais espécies do gênero Tospovirus, ZLCV é a única que demonstra uma restrição em relação ao espectro de hospedeiras, fato este que pode estar envolvido com a proteína de movimento viral (NSm) e a proteína supressora de silenciamento gênico (NSs). Estes pontos reforçam o principal objetivo do presente trabalho que é a caracterização da proteína supressora de silenciamento NSs e um comparativo molecular desta com as demais NSs caracterizadas até o momento dentro do gênero e dentro da família do vírus. Além desse aspecto, ZLCV vem demonstrando um aumento de incidência infectando cucurbitáceas, ficando atrás apenas de Papaya ringspot virus (PRSV-W) e Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV). Diante dessa problemática surgem mais dois objetivos no trabalho, o entendimento mais amplo em relação ao espectro de hospedeiras do vírus e o desenvolvimento de um antisoro eficiente para a diagnose do vírus. Para a caracterização molecular da NSs do ZLCV, foi utilizado um primer (Oligonucleotídeo) degenerado sentido senso que se anelou após o códon iniciador e um antisenso, que se anelou na região hairpin (em formato de grampo) do segmento S do genoma viral. Esta combinação resultou na amplificação de um fragmento de aproximadamente 2.000 pb da NSs do vírus e parte da região intergênica do segmento S, faltando apenas um pequeno fragmento para o sequenciamento total da NSs. Foi desenhado então outro primer antisenso que se anelou no início do genoma e que em combinação com o primer J13 que se anela na região consenso de todos os segmentos do genoma de vírus deste gênero, foi obtido o restante da seqüência. Comparando-se a NSs do ZLCV com segmentos correspondentes das demais espécies do grupo Americano e do grupo Euro- Asiático obteve-se identidade máxima de 73,2% com TSWV. Com base na análise de identidade e na análise fílogenética da proteína NSs de Tospovirus foi levantada a hipótese de que a restrição do círculo de hospedeiras do ZLCV poderia estar relacionada com a diferenciação de regiões da proteína NSs que tenham relação com a supressão do silenciamento. O que poderia estar causando a sua restrição em relação à infecção de novas hospedeiras. A demais é sugerida a utilização das proteínas NSs como um valor adicional na classificação das espécies do gênero Tospovirus. Para a produção do anti-soro foram imunizados dois coelhos. O anticorpo produzido apresentou reação cruzada com TCSV e GRSV, entretanto, em uma concentração de 1:500 foi possível diagnosticar a presença do ZLCV na planta e a ausência de reação cruzada. No círculo de hospedeiras foram testadas 23 diferentes cultivares de cucurbitáceas (um aumento relevante em relação aos outros ensaios já feitos de espectro de hospedeiras do vírus), além de plantas pertencentes a outras famílias como Solanaceae, Convolvulaceae, Amaranthaceae, Fabaceae e Chenopodiaceae. Foi identificada por sorologia e/ou reação da polimerase em cadeia (PCR) a presença do ZLCV em um número pequeno de plantas o que não representa uma co-evolução do vírus para à infecção de hospedeiras alternativas. O ensaio sorológico contribuirá para otimizar a diagnose viral, considerando que ZLCV vem ocorrendo em maior incidência em plantações de cucurbitáceas. O ensaio biológico e o ensaio molecular geraram informações que contribuíram ao melhor entendimento da relação patógeno x hospedeira, considerando-se que ZLCV é uma espécie dentro do gênero Tospovirus que apresenta restrição em relação a plantas hospedeiras. O entendimento dos eventos que induzem a essa restrição podem, de alguma forma, ser empregados na determinação de medidas a serem empregadas no controle das espécies de Tospovirus.The genus Tospovirus belongs to the Bunyaviridae family and has Tomato spotted wilt vírus (TSWV) as type species. Species within this genus are of great relevance to vegetable crops, especially, on tomatoes and peppers on which these viruses can cause severe economical losses. In addition to TSWV, there are other Topovirus species which have an impact on vegetable production in the country, such as Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) infecting cucurbits, especially squash, Groundnut ringspot virus (GRSV) on tomato, pepper and lettuce, Tomato chlorotic spot virus (TCSV) on tomato and pepper, Chrysanthemum stem necrosis virus (CNSV) on ornamental plants and íris yellow spot virus (IYSV) on onion. The disease caused by these viruses is commonly called a "top distortion of tomato planf, being among the major diseases on various groups of plants. In cucurbitaceous the disease is known as lethal yellowing of squash. Zucchini lethal chlorosis virus has been detected and characterized only in Brazil, mainly in cucurbit producing areas of the State of São Paulo and State of Tocantins. This virus infects squash, melon and watermelon crops. Comparing to other Tospovirus species found in Brazil, ZLCV is reported to infect just a few plant species, which may be related to the viral movement protein (NSm) and/ or to the gene silencing suppressor protein (NSs). From this premise, the main objective of this work was to perform the molecular characterization of the NSs, putative silencing suppressor protein and also to perform a comparative analysis with other NSs proteins characterized until now within the genus Tospovirus and within the Bunyaviridae family. Also, considering that ZLCV incidence in cucurbit species has increased in the last years, the present work includes an investigation on the host range of ZLCV and also the development of an antiserum to be used in lhe ZLCV detection. To obtain the sequence of ZLCV NSs to perform the molecular characterization, a pair of primers was used in an RT-PCR reaction. A forward degenerate primer was designed which annealed after the start codon onto the viral sequence and a reverse primer (UHP) that annealed onto the "hairpin" region of the genome sequence of the S RNA segment. That primer combination amplified a 2000 bp fragment which corresponded to the NSs partial sequence and part of the intergenic region of the S segment. In order to obtain the complete NSs sequence including the C-terminal sequence of S RNA, another reverse primer was designed to anneal onto the 5' end region of the NSs sequence. The reverse primer in combination with J13 primer (anneal onto the consensus region present in ali three segments of the viral genome within the genus) made it possible to amplify the remaining fragment and complete the NSs sequence. Comparative analysis of nucleotide and amino acid sequences of the NSs ZTCV with the corresponding sequences of other tospovirus clustered in the American and in the Asian groups indicated a maximum identity of 73.2% with TSWV NSs sequence. Based on the identity and on the phylogenetic analysis of the NSs and NSm proteins of tospoviruses it was hypothesized that the restriction of the host range of ZTCV may be related to the gene silencing suppressor protein (NSs) and viral movement protein (NSm) influencing virus/ host interactions. Analysis of amino acid sequences of the NSm protein showed that ZTCV and INSV differ most from other species in the American group. In addition, larger identity value of 71% was observed between ZTCV and of CSNV NSm proteins. Considering that, it is likely that non-structural proteins of tospoviruses may be associated to virus pathogenicity and having some iníluence on the size of its host range. Beyond the hypothesis suggested the use of NSs proteins as an additional parameter in the classification of the genus Tospovirus. Antiserum produetion was carried out using two rabbits. By dot- EL1SA, the ZTCV antibodies cross-reacted with TCSV and GRSV and at 1:500 dilution it was possible to detect just ZTCV presence in infected plants. To investigate the host range of ZTCV, 23 cucurbit plants including different cultivars and species, and also species from Solanaceae, Convolvulaceae, Amaranthaceae, Fabaceae and Chenopodiaceae families were tested in this assay. Virus detection on inoculated plants was done by serology and by PCR and the results indicated ZTCV presence in just a few plant species and/or cultivars, indicating no evolution in virus infection of new hosts, therefore confirming the restrict host range nature of the ZTCV. Considering that ZLCV has been occurring in an increasing incidence in cucurbit crops, within the last years, the antiserum produced in this work will contribute to a better viral diagnosis. The biological and the molecular data generated will contribute to a better understanding of host pathogen interaction, considering that ZLCV has a restricted host range when compared to other Tospovirus species. These data ali together will help to understand the host range restriction of this Tospovirus species which may be useful to search for strategies virus control