Amperometric biosensor based on tyrosinase applied for the indirect determination of traces of pesticides

An amperometric biosensor based on tyrosinase enzyme was developed and investigated for monitoring of Parathion Methyl, Carbaryl, Carbofuran and Diazinon. The enzyme was immobilized on a cobalt (II) phtalocyanine modified graphite composite electrode (CoPc-GCE) by cross-linking with glutaraldehyde and bovine serum albumin. Several parameters which affect the response of tyrosinase biosensor referring to catechol as substrate were examined. The response of the CoPc-GE towards the catechol was investigated in terms of the detection limit (LOD), response stability and electrode fouling by the of polymeric oxidation products. These parameters were compared with the ones obtained with an unmodified carbon paste electrode (CPE) and a cobalt (II) phtalocyanine modified carbon paste electrode (CoPc-CPE). The CoPc-GCE exhibited the highest LOD to catechol, 1.0 x 10-6 mol L-1. Additionally, this electrode exhibited a stable baseline and a time-independent current intensity. The intensity of the current was approximately unchanged for 65 catechol measurements against 2-3 measurements reported to the others electrodes. Various experimental parameters were explored for optimum analytical performance of the biosensor. The catechol was determined by the direct reduction of biocatalytically liberated o-quinone at 0.20 V vs Ag/AgCl (3.0 mol L-1 KCl). The results showed that highest amperometric responses were found in 0.05 mol L-1 phosphate buffer with 0.1 mol L-1 KCl, and pH 6.50. The linear range for the reported biosensor was 5.0 x 10-5 a 1.0 x 10-3 mol L-1 for catechol. The sensitivity was ca. 1.6 x 10-5 μA mol -1 L. The immobilized enzyme yields specific activities to catechol higher than that of free enzyme. The apparent Michaelis-Menten constant (KM app) value of immobilized enzyme was 1.7 mM while that of soluble enzyme was 2.3 mM. Inhibition studies were carried out by using Methyl Parathion, Diazinon, Carbaryl and Carbofuran, respectively. The decrease of the rate of reduction in the current due to produced o-quinone was used for evaluation. All four compounds showed a linear dependence between the concentration and the relative inhibition. Recovery studies employing the best conditions were carried out by using water samples spiked with the inhibitors at levels of 30 ppb, respectively. The recoveries ranged between 93 % and 99 % with coefficients of variation of 1.01 2.09 %.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorMestre em QuímicaUm biossensor amperométrico baseado na enzima tirosinase foi desenvolvido e investigado para o monitoramento dos agrotóxicos Metil Paration, Carbaril, Carbofuran e Diazinon. A enzima foi imobilizada sobre um eletrodo compósito de grafite modificado com ftalocianina de cobalto (II) (ECG-FtCo) por cross-linking com glutaraldeído e albumina de soro bovino. Vários parâmetros que afetam a resposta do biossensor tirosinase para o catecol como substrato foram estudados. A resposta do ECG-FtCo para o catecol foi investigada em termos do limite de detecção (LD), estabilidade e passivação do eletrodo pelos produtos poliméricos. Esses parâmetros foram comparados com aqueles obtidos com o eletrodo de pasta de carbono não modificado (EPC) e o eletrodo de pasta de carbono modificado com ftalocianina de cobalto (II) (EPC-FtCo). O ECG-FtCo apresentou o maior LD para catecol, 1,0 x 10-6 mol L-1. Além disso, este eletrodo apresentou a corrente residual voltamétrica baixa e mais estável com uma intensidade de corrente independente do tempo. A corrente residual voltamétrica manteve-se aproximadamente inalterada por 65 medidas de catecol contra duas a três medidas realizadas com outros eletrodos. Vários parâmetros experimentais foram explorados para avaliar a melhor performance analítica do biossensor. O catecol foi determinado pela redução direta da oquinona produzida enzimaticamente à -0,20 V vs Ag/AgCl (KCl 3,0 mol L-1). Os resultados mostraram que as maiores respostas amperométricas eram encontradas em tampão fosfato 0,05 mol L-1 contendo KCl 0,1 mol L-1, pH 6,50. A faixa linear de resposta para o biossensor foi de 5,0 x 10-5 a 1,0 x 10-3 mol L-1 para o catecol. A sensibilidade para catecol foi ao redor de 1,6 x 10-5 μA mol -1 L. A enzima imobilizada apresentou atividade especifica ao catecol maior do que a apresentada pela enzima livre. A constante aparente de Michaelis-Menten (KM app) da enzima imobilizada foi 1,7 mM enquanto para a enzima livre foi 2,3 mM. Estudos de inibição foram realizados utilizando-se Metil Paration, Diazinon, Carbaril e Carbofuran, respectivamente. Nesse estudo, foi usada a diminuição da taxa da corrente de redução devido a o-quinona produzida para quantificar os pesticidas indiretamente. Todos os compostos mostraram uma dependência linear entre a concentração e a inibição relativa. Estudos de recuperação empregando as melhores condições foram realizados utilizando-se amostras de água fortificadas com os inibidores em níveis de 30 ppb, respectivamente. As recuperações variaram entre 93 % e 99 % com coeficientes de variação de 1,01 a 2,09 %