In vitro and in planta characterization of a chimeric antimicrobial protein against the phytopathogen Ralstonia solanacearum

The phytobacterium Ralstonia solanacearum [(SMITH, 1896) YABUUCHI et al. 1996], causative agent of bacterial wilt and Moko disease, is considered one of the world s most destructive plant pathogen. In Brazil this xylem-restricted bacterium reduces yields of agriculturally important crops and calls for effective disease management strategies, so far limited to preventive actions. Antimicrobial peptides have been considered powerful compounds for plant protection due to their antiviral, antifungal, and antibacterial activities. Hence, they are promising candidates to the development of novel rationally-designed therapies for the control of R. solanacearum. Mirroring the function and properties of cecropin B, a well-studied α-helical antimicrobial peptide (AH-AMP), several candidates were selected by bioinformatic tools and tested in vitro against the bacterium. The identified peptides included a linear AH-AMP within the existing structure of phosphoenolpyruvate carboxylase, named PPC20. This peptide stood out as the most efficient in killing the pathogen without jeopardizing human cells. In order to investigate whether the combination of two innate immune functions provides a robust class of antimicrobial therapeutics, this lytic domain was combined to a putative plant-derived elastase (the pathogenesis-related protein SlP14a), leading to the development of a chimeric protein. To characterize and validate this novel antimicrobial chimera as a biocontrol agent, bioassays were conducted in vitro and in planta. SlP14a and SlP14a-PPC20 were expressed in both bacterial and plant (transient expression) systems. Purified proteins showed in vitro antibacterial activity by inhibiting R. solanacearum growth. In order to explore the in vivo biological function of SlP14a-PPC20, transgenic lines of tomato cultivar MoneyMaker were obtained and characterized. To assess whether these lines acquired enhanced tolerance to the pathogen, they were challenged with R. solanacearum by stem inoculation. The survival rates and the reduction of disease symptoms were significantly higher in transgenic plants compared with the non-transgenic ones. This study proposes an alternative strategy for bacterial wilt control based on expression of a newly designed therapeutic antimicrobial protein in tomato plants.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoDoutor em AgronomiaA fitobactéria Ralstonia solanacearum [(SMITH, 1896) YABUUCHI et al. 1996], agente causal da murcha-bacteriana e da doença do Moko, é considerada um dos mais destrutivos patógenos de plantas em todo o mundo. No Brasil, sua ocorrência compromete o rendimento de culturas agronomicamente importantes, destacando a necessidade de estratégias eficazes para o manejo da doença, até então limitadas a ações preventivas. Peptídeos antimicrobianos (AMPs) participam da defesa inata de inúmeros organismos e são considerados potenciais agentes terapêuticos no combate a ampla variedade de patógenos, em virtude de suas propriedades antivirais, antifúngicas e antibacterianas. Visto isso, são candidatos promissores para o desenvolvimento de novas terapias no controle de R. solanacearum. Mediante o uso de ferramentas de bioinformática, vários AMPs foram selecionados baseando-se na estrutura e função da cecropina B, um conhecido peptídeo antimicrobiano α-helicoidal (AH-AMP), e testados in vitro contra a bactéria. Dentre os peptídeos identificados, um AH-AMP derivado da enzima fosfoenolpiruvato carboxilase, denominado PPC20, destacou-se como o mais eficiente para controlar o patógeno, simultaneamente configurando baixa toxicidade a células humanas. No intuito de verificar se a combinação de duas funções imunes inatas presentes na mesma molécula potencializa seu efeito antimicrobiano, esse domínio lítico foi fusionado a uma elastase putativa derivada de plantas (a proteína relacionada à patogênese, SlP14a), resultando no desenvolvimento de uma quimera. A caracterização e validação dessa nova proteína quimérica foi realizada por bioensaios conduzidos in vitro e in planta. Os genes SlP14a e SlP14a-PPC20 foram clonados e expressos em células bacterianas e em plantas de tabaco (expressão transiente). As proteínas extraídas e purificadas de ambos os sistemas de expressão apresentaram atividade antibacteriana in vitro através da inibição do crescimento de R. solanacearum. A fim de verificar a função biológica in vivo da quimera (SlP14a-PPC20), linhagens transgênicas de tomate (cultivar MoneyMaker) foram obtidas e inoculadas com R. solanacearum. Os índices de sobrevivência e a redução dos sintomas da murcha-bacteriana foram significativamente mais elevados em plantas transgênicas quando comparados com aqueles relativos às plantas não transformadas. Este estudo propõe uma estratégia alternativa para o controle da murcha-bacteriana mediante a expressão de uma nova proteína terapêutica antimicrobiana em plantas de tomate