Marcadores genéticos de risco para forte produção de biofilme em cepas clínicas de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina e sua associação com o perfil clonal

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the major human pathogens worldwide and its epidemiology has been the focus of numerous single and multicenter surveillance studies over the past years. In this study, a phenotypic and genotypic approach were used to determine the factors that influence adherence and biofilm production of the most common MRSA SCCmec types, and its relationship with antimicrobial resistance, virulence genes and the genetic background of S. aureus isolates. The strains used in this study were selected from a collection of clinical MRSA strains recovered from patients hospitalized in the Teaching Hospital of the Federal University of Uberlandia, isolated from infections at various anatomical sites and evaluated for SCCmec type. Fifteen strains carrying different chromosomal cassettes were selected, five SCCmec II, five SCCmec III and five SCCmec IV, recovered predominantly from blood (67%), surgical site infections (27%) and pneumonia (6.0%). The SCCmec type, agr group and the presence of the virulence genes (bbp, clfA, icaA, icaD, fnbB, bap, sasC and IS256) were assessed by PCR. The genetic relationship between the isolates and a possible association with the ability to form biofilm were investigated by pulsed field gel electrophoresis (PFGE). The initial adhesion and biofilm formation were examined by quantitative assays. To evaluate the association between the hydrophobicity and the ability of MRSA cell to adhere to an unmodified polystyrene surface, the surface tension and hydrophobicity of the strains were measured by contact angle technique. There were association among the values of the electron acceptor parameter, the degree of hydrophobicity and adhesion ability. SCCmec III and IV strains were less hydrophilic, showed higher values of the electron acceptor parameter and adhered better than SCCmec II strains. The analysis of biofilm production showed that SCCmec III strains were characterized as strong biofilm producers; with the average biomass of biofilm from 0.53 ± 0.12 compared with 0.04 ± 0.04 those non-producers/weak producers (SCCmec II e IV). The analysis of this study showed five major pulsotypes according to the PFGE (A-E) with a large genomic diversity observed by the number of subtypes in each pulsotype. However, biofilm production was related to the dissemination of one specific PFGE clone (Clone C). The presence of the genes agrI, fnbB and IS256 in clinical MRSA SCCmec III strains, were considered as genetic risk markers for strong biofilm-formation by an icaindependent biofilm pathway. This study contributes for the understanding of biofilm production as a virulence factor potentially involved in the persistence and severity of infections caused by Staphylococcus aureus belonging to this genotype.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorDoutor em Imunologia e Parasitologia AplicadasStaphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) é um dos principais patógenos humanos em todo o mundo e sua epidemiologia tem sido foco de numerosos estudos de vigilância unicêntricos e multicêntricos ao longo dos últimos anos. Neste estudo utilizamos abordagens fenotípicas e genotípicas para determinar os fatores que influenciam a adesão inicial e produção de biofilme em cepas clínicas de MRSA carreando os tipos de cassete cromossômico estafilocócico (SCCmec) mais frequentes nos hospitais brasileiros, e sua relação com resistência, genes de virulência e perfil clonal. As cepas de MRSA utilizadas neste estudo foram selecionadas a partir de uma coleção de amostras clínicas recuperadas de pacientes internados no Hospital de Clínicas da Universidade Federal de Uberlândia, isoladas de infecções em diversos sítios anatômicos. Foram selecionadas para o estudo quinze cepas carreando diferentes cassetes cromossômicos, cinco SCCmec II, cinco SCCmec III e cinco SCCmec IV, recuperadas predominantemente de sangue (67%), sítio cirúrgico (27%) e pneumonia (6,0%). O tipo de SCCmec, o grupo agr e a presença de genes de virulência (bbp, clfA, icaA, icaD, fnbB, bap, sasC e IS256) foram avaliados por PCR. A relação genética entre as amostras e a possível associação com a capacidade de formação de biofilme foram investigadas por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). A adesão inicial e a capacidade de formação de biofilme foram examinadas por ensaios quantitativos. Adicionalmente, a associação entre a hidrofobicidade e a capacidade da célula de MRSA aderir a uma superfície de poliestireno não modificada, foi avaliada através da medida dos ângulos de contato. Houve associação entre o grau de hidrofobicidade e a capacidade de adesão. Cepas clínicas de MRSA carreando SCCmec III e IV foram menos hidrofílicas, apresentaram valores mais altos de tensão interfacial do componente aceptor de elétrons e aderiram melhor do que as cepas SCCmecII. As análises da produção de biofilme mostraram que cepas carreando SCCmec III foram caracterizadas como fortemente produtoras de biofilme, com a média da biomassa do biofilme de 0,53 ± 0,12 em comparação com 0,04 ± 0,04 daquelas nãoprodutoras/ fraco produtoras (SCCmec II e SCCmec IV). A tipagem molecular por PFGE evidenciou cinco pulsotipos (A-E) com uma grande diversidade clonal observada pelo número de subtipos em cada pulsotipo. Entretanto, a produção de biofilme esteve relacionada a disseminação de um clone específico (Clone C). Os genes agrI, fnbB e IS256 em cepas clínicas de MRSA carreando SCCmec III, foram considerados marcadores genéticos de risco para forte produção de biofilme por uma via independente de ica. Nosso estudo contribui para a compreensão da produção de biofilme como um fator de virulência, potencialmente envolvido na severidade e persistência de infecções causadas por S. aureus pertencentes a este genótipo