IgY anti-Strongyloides venezuelensis: production, characterization and application in the immunodiagnosis of human strongyloidiasis

In view of the epidemiological problem of the neglected condition of human strongyloidiasis, a rapid and effective diagnosis is extremely important. The development of new diagnostic tools is essential to avoid hyperinfections and chronic cases in the course of this geohelminthiasis. IgY technology is an alternative for antibody production with high specificity and profitability. This study aimed to produce and fracionate IgY antibodies from egg yolks of hens immunized with total antigenic extracts of Strongyloides venezuelensis infectious filariform larvae (iL3) and parthenogenetic females (pF). The IgY antibodies produced were evaluated by the recognition of parasitic proteins, life forms and serological diagnosis of human strongyloidiasis. They were also used for the selection of phage clones with expressed peptides binding of the IgY molecules by phage display, for immunodiagnostic application of the disease. Five immunizations were performed with Freund's adjuvants at 14-day interval. Eggs and serum samples were obtained to monitor the production of specific antibodies. Egg yolks were purified by water dilution method and protein precipitation by ammonium sulfate, followed by fractionation in tiophilic interaction chromatography. The fractionation and antibodies specificity were confirmed by dot-blot, electrophoresis, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), ELISA avidity, immunoblotting and immunofluorescence antibody test (IFAT). Applications in the immunodiagnostic of strongyloidiasis, using human serum samples, were performed by detection of immune complexes with IgY antibodies by ELISA, and by detection of circulating IgG, with peptide-fused clones selected in two different biopanning strategies, by phage-ELISA. Proteins from heavy (65kDa) and light (22-24kDa) chains of IgY molecules were visualized on 12 % SDS-PAGE. The specificity was confirmed by recognition of protein bands from the total extracts and by IFAT in histological sections of S. venezuelensis (iL3 and pF). Antibodies showed levels of avidity ranging from 68.0 % to 95.4 %. The detection of immune complexes in serum samples showed diagnostic values of sensitivity (Se) and specificity (Sp) for anti-iL3 IgY and anti-Fp IgY antibodies respectively: Se: 95.56 % and Sp: 88.89 %; Se: 95.56 % and Sp: 91.11 %. Biopanning strategies selected phage clones fusedpeptides with structures similar to Strongyloides stercoralis proteins, which caused the infection in humans. Six main phage clones were identified, being two (C12 and D4) considered with the best diagnostic values for IgG detection in human serum samples (D4 - Se: 82.2 %, Sp: 83.3 %, C12 - Se: 80.0 %, Sp: 82.2 %). IgY technology can be an important tool for the strongyloidiasis study with possibilities for application in disease therapeutics and as a serological diagnostic method.CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorTese (Doutorado)Diante da realidade epidemiológica e do negligenciamento da estrongiloidíase humana, o diagnóstico rápido e eficaz é uma condição de extrema importância. O desenvolvimento de novas plataformas diagnósticas é essencial para evitar ou diminuir a manutenção de casos crônicos e hiperinfecções disseminadas no curso desta geohelmintíase. A tecnologia IgY é uma alternativa para a produção de anticorpos policlonais com elevado grau de especificidade e rentabilidade. O objetivo do estudo foi produzir e fracionar anticorpos IgY provenientes de gemas de ovos de galinhas poedeiras, imunizadas com extratos antigênicos de larvas filarioides infectantes (iL3) e fêmeas partenogenéticas (Fp) de Strongyloides venezuelensis. Os anticorpos IgY produzidos foram avaliados no reconhecimento de proteínas parasitárias, cortes histológicos de formas de vida do parasita e no diagnóstico sorológico da estrongiloidíase humana. Foram utilizados ainda para a seleção, por phage-display, de clones de fagos com peptídeos expressos, ligantes das moléculas de IgY, para aplicação imunodiagnóstica da doença. Cinco imunizações foram realizadas com adjuvantes de Freund em intervalos de 14 dias. Ovos e amostras de soro foram obtidos para monitorar a produção de anticorpos IgY específicos. As gemas dos ovos foram purificadas pelo método de diluição em água, seguidas de precipitação de proteínas com sulfato de amônio e fracionamento em cromatografia de interação tiofílica. O fracionamento e a especificidade dos anticorpos IgY foram confirmados por testes dot-blot, eletroforese em gel de poliacrilamida, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), ELISA avidez, immunoblotting e reações de imunofluorescência indireta (RIFI). As aplicações no imunodiagnóstico da estrongiloidíase, utilizando amostras de soro de pacientes, foram realizadas pela detecção de imunocomplexos pelos anticorpos IgY em testes ELISA, e pela detecção de IgG circulante pelos clones de fagos com peptídeos fusionados, selecionados em duas estratégias diferentes de biopanning, por testes phage-ELISA. Bandas polipeptídicas das cadeias pesadas (65 kDa) e leves (22-24 kDa) das moléculas de IgY foram visualizadas em SDS-PAGE 12 %. A especificidade dos anticorpos IgY foi confirmada pelo reconhecimento de bandas proteicas dos extratos antigênicos totais e de estruturas em cortes histológicos de S. venezuelensis (iL3 e Fp). Os anticorpos IgY apresentaram índices de avidez variando de 68,0 % a 95,4 %. A detecção de imunocomplexos nas amostras de soros dos pacientes apresentaram valores diagnósticos de sensibilidade (Se) e especificidade (Es) para IgY anti-iL3 e IgY anti-Fp respectivamente: Se: 95,56 % e Es: 88,89 %; Se: 95,56 % e Es: 91,11 %. As estratégias de biopanning selecionaram clones de fagos que expressam peptídeos de estruturas similares a proteínas de Strongyloides stercoralis, causador da infecção em seres humanos. Foram identificados seis principais clones de fagos, sendo dois (C12 e D4) considerados com melhores valores diagnósticos na detecção de IgG em amostras de soro de pacientes (D4 – Se: 82,2 %, Es: 83,3 %; C12 – Se: 80,0 % , Es: 82,2 %). A tecnologia IgY pode ser considerada uma importante ferramenta no estudo da estrongiloidíase humana com possibilidades de aplicação no diagnóstico sorológico e na terapêutica da doença