Localização de alterações cromatínicas em espermatozoides de touro e sua relação com a marcação imunocitoquimica de protamina

Changes in the chromatin of sperm have been linked to subfertility in several species of mammals. One of the factors that leads to these changes is protamine deficiency. In this study we analyzed the location of changes of chromatin in the sperm of bulls and the relationship with the markup of protamine immunocytochemistry. Semen samples of fertile and subfertile bulls were examined through computational analysis of images of smears stained with toluidine blue (TB), DAPI and marked with protamine 1 (PR1) antibody. For the evaluation TB blades were used in two separate analyses: a conventional, where we obtained the value of decompression percentage (DESC%) and average chromatin heterogeneity (HET) of sperm, and an alternative, which labels changes according to the location of the change in the head of the sperm and percentage of sperm with each type of change in the samples. In both was compared samples from fertile and subfertile bulls. Conventional analysis showed a significant increase (p = 0.01) both DESC% and HET in subfertile samples. On the other hand, alternative analysis showed an increase in subfertile samples of changes in basal half (AMB) p = 0.05 and totally changed heads (CTA) p = 0.04. This alternative computational analysis was also applied to staining with DAPI, where the subfertile samples showed an increase in base alterations (AB) p = 0.02. The dispersed changes (AD) were higher with p = 0.02 in the fertile samples. On labeling with anti-PR1, changes in the base (AB) were higher in subfertile samples with p = 0.01. With these results we conclude that, with the alternative technique was possible to propose a classification of changes in staining and immunolabelling, but this technique showed a low efficiency to distinguish fertile from subfertile bulls. DAPI staining assessed in confocal microscopy is presented as a possible alternative for staining with AT. The conventional technique with AT showed the best result for differentiation between fertile and subfertile groups. PR1 Immunostaining showed that this protein is distributed throughout the bull sperm head, and that chromatin alterations in these cells have no relation with the amount of PR1.Mestre em Biologia Celular e Estrutural AplicadasAs alterações na cromatina dos espermatozoides vêm sendo relacionada como causa de subfertilidade em diversas espécies de mamíferos. Um dos fatores que leva a essas alterações é a deficiência de protamina. No presente trabalho analisou-se a localização das alterações da cromatina de espermatozoides de touros e a sua relação com a marcação imunocitoquímica da protamina. Amostras de sêmen de touros férteis e subférteis foram examinadas pela análise computacional de imagens de esfregaços corados com azul de toluidina (AT), DAPI e marcados com anticorpo anti protamina 1 (PR1). Para avaliação das lâminas de AT foram utilizadas duas análises computacionais distintas: uma convencional, em que se obtêm o valor da descompactação percentual (DESC%) e heterogeneidade (HET) médias da cromatina dos espermatozoides e outra alternativa, na qual se classifica as alterações de acordo com a localização da alteração na cabeça do espermatozoide e se calcula a porcentagem de espermatozoides com cada tipo de alteração nas amostras. Em ambas se comparavam as amostras de touros férteis e subférteis. A análise convencional mostrou um aumento significativo (p=0,01) tanto de DESC% quanto de HET nas amostras subférteis. Já análise alternativa mostrou um aumento nas amostras subférteis das alterações na metade basal (AMB) p=0,05 e cabeças totalmente alteradas (CTA) p=0,04. Essa análise computacional alternativa também foi aplicada à coloração com DAPI onde as amostras subférteis apresentaram um aumento das alterações na base (AB) p=0,02. Já as alterações dispersas (AD) foram maiores com o p=0,02 nas amostras férteis. Na marcação com anti-PR1 as alterações na base (AB) mostraram-se maiores nas amostras subférteis com o p=0,01. A porcentagem de coincidência das marcações com DAPI e anti-PR1 foi baixo. Com esses resultados concluímos que, com a técnica alternativa foi possível propor uma classificação das alterações nas colorações e na imunomarcação, porém essa técnica apresentou uma baixa eficiência para distinguir touros férteis dos subférteis. A coloração com DAPI avaliada em microscopia confocal se apresentou como uma possível alternativa para a coloração com AT. A técnica convencional com AT foi a que mostrou um melhor resultado para diferenciação entre os grupos férteis e subférteis. A imunomarcação de PR1 mostrou que essa proteína se distribui por toda cabeça do espermatozóide de touro e que as alterações cromatínicas nessas células não possuem relação com a quantidade de PR1