Estudo epidemiológico molecular da resistência aos carbapenêmicos em Pseudomonas aeruginosa isoladas de sangue: produção de β-lactamases, perda de porina OprD e hiperexpressão de bombas de efluxo

Introduction: The spread of Pseudomonas aeruginosa variants associated with the emergence of carbapenem resistance genotypes, is of great concern worldwide. Objectives: Molecular epidemiological study of carbapenem resistance in isolates of P. aeruginosa from blood. Material and Methods: We conducted a prospective observational study through active surveillance in the HC-UFU Microbiology Laboratory for detection of patients with P. aeruginosa bacteremia, from May/2009 to December/2012. The mechanisms of resistance to carbapenems were studied based on phenotypic methods, including Synergy Test with Double Disk and Hodge Test, and genotypic to detection of carnapenemase genes, including MBL genes (blaIMP, blaVIM, blaSIM, blaGIM e blaSPM) and OXA genes (blaOXA-51, blaOXA-23, blaOXA-40 e blaOXA-58) by multiplex PCR and gene blaKPC by end point PCR. The qRT-PCR technique was conducted to determine the intrinsic resistance mechanisms: overproduction of AmpC, overexpression of efflux pumps (MexABOprM, MexXY, MexCDOprJ, MexEFOprN) and loss of OprD porin. The PFGE was used to molecular typing of isolates presenting MBL genes. Results: 157 patients admitted to the HC-UFU with P. aeruginosa bacteremia were included. A total of 162 episodes/isolated bacteremia were observed, with the adult ICU presenting the highest rates of isolates resistant to carbapenems. A high consumption of ceftriaxone, cefepime and meropenem was observed, with an increasing trend until the end of the study period, and no positive correlation with carbapenems resistant isolates, however we observed an outbreak of these isolates in December 2010, predominantly in adult ICU. The mortality rate was high (43.3%) and the multivariate analysis showed that the predictors independently associated with death were patients with cancer and with inappropriate antimicrobial therapy, particularly from cefepime use. Risk factors associated with antimicrobial resistance were: hospital stay ≥ 30 days, ICU admission, prior use of antibiotics, and presence of invasive procedures, including tracheostomy, hemodialysis and urinary catheter. The mortality rates were higher among patients with resistant isolates. The inappropriate antibiotic therapy was a strong marker of worse prognostic. The MBL production was conducted in 56 isolated, with positivity of 21.4% by the phenotypic test, of which 75.0% presented amplicon consistent with MBL genes, being 66.7% of blaSPM-1 type and 33.3% of blaVIM. Of the 47 non-MBL carbapenems resistant isolates, none had another type of carbapenemase, and 14 were included in the study of resistance mechanisms from qRT-PCR, with rates of AmpC overproduction and OprD porin loss of 71,4%, for both. The rates of MexABOprM and MexXY overexpression were 57,1% and 64.3%, respectively. The evaluation of the clonal relationship among isolates with MBL genes, showed high similarity of those isolates presenting blaSPM, which was not observed for those containing the blaVIM gene. Conclusions: Our results showed that inappropriate therapy is a significant worse prognosis factor among patients with bacteremia resistant P. aeruginosa. In the absence of effective carbapenemase, P. aeruginosa isolates presented association of other resistance mechanisms. Furthermore, this study showed a cross spread of blaSPM clone and the first report of blaVIM at HC-UFU.Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas GeraisDoutor em Imunologia e Parasitologia AplicadasIntrodução: A disseminação de variantes de Pseudomonas aeruginosa associada à emergência de genótipos de resistência aos carbapenêmicos, é de grande preocupação no mundo todo. Objetivos: Realizar estudo epidemiológico-molecular da resistência aos carbapenêmicos em isolados de P. aeruginosa recuperados de sangue. Material e Métodos: Para avaliação epidemiológica, foi realizado um estudo observacional prospectivo por meio de vigilância ativa no Laboratório de Microbiologia do HC-UFU para detecção de pacientes com bacteremia por P. aeruginosa, no período de maio/2009 a dezembro/2012. A pesquisa dos mecanismos de resistência aos carbapenêmicos baseou-se em métodos fenotípicos, teste de sinergismo com duplo disco e teste de Hodge, e genotípicos para detecção de carbapenemases, incluindos genes MBL (blaIMP, blaVIM, blaSIM, blaGIM e blaSPM) e genes OXA (blaOXA-51, blaOXA-23, blaOXA-40 e blaOXA-58) por PCR multiplex e gene blaKPC por PCR end point. A técnica do qRT-PCR foi utilizada para detecção dos mecanismos de resistência intrínsecos: hiperprodução de AmpC, hiperexpressão de bombas de efluxo (MexABOprM, MexXY, MexCDOprJ, MexEFOprN) e perda de porina OprD. Através do PFGE foi realizada a tipagem molecular dos isolados positivos para genes MBL. Resultados: 157 pacientes internados no HC-UFU com bacteremia por P. aeruginosa foram incluídos no estudo. No total, 162 episódios/isolados de bacteremia foram observados, sendo a UTI de adultos, a unidade hospitalar com maiores taxas de isolados resistentes aos carbapenêmicos. Foi observado um alto consumo de ceftriaxone, cefepime e meropenem, com tendência ascendente até o final do período de estudo, sem correlação positiva com isolados resistentes aos carbapenêmicos, entretanto foi observado um surto desses isolados em dezembro de 2010, predominantemente na UTI de adultos. A taxa de mortalidade entre os pacientes foi elevada (43,3%) e a análise multivariada mostrou que os preditores independentemente associados com óbito foram câncer e terapia antimicrobiana inapropriada, particularmente pelo uso de cefepime. Os fatores de risco associados com resistência aos antimicrobianos foram: tempo de hospitalização ≥ 30 dias, admissão na UTI, uso prévio de antimicrobianos, e presença de procedimentos invasivos, incluindo traqueostomia, hemodiálise e cateter urinário. Pacientes com bacteremia por isolados resistentes aos antimicrobianos tiveram maiores taxas de mortalidade hospitalar, com a terapia antimicrobiana inapropriada sendo um forte marcador de prognóstico ruím. A pesquisa de produção de MBL foi realizada em 56 isolados, com positividade de 21,4% pelo teste fenotípico, dos quais 75,0% tiveram amplicon consistente com genes pesquisados, sendo 66,7% do tipo blaSPM-1 e 33,3% blaVIM. Dos 47 isolados resistentes aos carbapenêmicos e não-MBL, nenhum apresentou outro tipo de carbapenemase. 14 isolados foram incluídos na pesquisa de mecanismos de resistência através da técnica de qRT-PCR, com taxas de positividade de 71,4% para hiperprodução de AmpC e perda de porina OprD, e de 57,1% e 64,3% para hiperexpressão de MexABOprM e MexXY, respectivamente. A avaliação da relação clonal entre isolados contendo os genes MBL, apresentou alta similaridade naquelas contendo blaSPM, o que não foi observado para aqueles contendo o gene blaVIM. Conclusões: Ficou evidenciado que a terapia inapropriada é fator significativo para pior prognóstico entre os pacientes com bacteremia por P. aeruginosa resistente. Na ausência de carbapenemase efetiva, isolados de P. aeruginosa apresentam frequentemente associação de outros mecanismos de resistência. Além disso, foi evidenciado uma disseminação cruzada do clone blaSPM e o primeiro relato de blaVIM no HC-UFU