Structural and functional analysis of Toxoplasma gondii dense granule proteins through the genetic editing using CRISPR / CAS9

Apicomplexan pathogens are the greatest threats to human and animal health in the world. Toxoplasma gondii is one of the protozoa belonging to this phylum, capable of infecting any nucleated cell. As an obligate intracellular protozoan, entry into the host cell is a crucial event to its survival. The host cell invasion is an active process in which the parasite recruits part of the host cell membrane to form the parasitophorous vacuole (PV). Whereas the PV helps protect the parasite from host cell elimination, the PV membrane (PVM), forms a physical barrier which deprives parasites of an abundant source of nutrients from the host’s endocytic and exocytic system. To overcome this problem the parasite secretes proteins that associate with the PVM, modulating its permeability allowing bidirectional diffusion of small molecules, probably through pores in the PVM. On the other hand, the host cells are able to recognize parasitic molecules in contact with their membranes or that are released into their cytoplasm, inducing the activation of crucial mechanisms for their resistance to infection. However, so far, the molecular basis of this hypothetical pore has not been reported, as well as there is little knowledge about the parasite agonists of innate receptors, being these the central goals of investigation in this work. In a first approach, GRA17 was identified as a protein secreted to the PVM that mediates passive transport of small molecules across the PVM, and its deletion induces slow parasitic proliferation and abrupt decline in virulence. Besides strongly predicted α-helices in the GRA17 composition, these were not functionally characterized. In the first chapter, we predict eight α-helix domains in the secondary structure of GRA17, which were individually truncated using the system Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR/ CRISPR associated protein 9-CAS9 (CRISPR/CAS9), in order to functionally characterize them. Through this approach, we show that with the exception of α-8, all the others predicted α-helices are required for GRA17 normal function, localization and PV stability. The truncation of these 7 motifs results in GRA17 mislocalization on the PVM and an aberrant PV morphology. Furthermore, GRA17 truncated parasites proliferate slowly and shows a decrease viability, leading us to the conclusion that the 7 α-helix structures of GRA17 are crucial for protein function and consequent viability of the parasite. Furthermore, we sought to understand the mechanisms of host resistance, arising from the antigens release during the replication process. We use Lewis rats that was identified to be completely resistant to Toxoplasma infection. Previous findings have established that this resistance is mediated by the activation of the cytosolic sensor NLRP1, which results in the rapid host cell death through piroptose, limiting parasitic replication. However, the targets involved in NLRP1 activation were not identified. To identify the parasite genes involved in the activation of this pathway, we used a chemical mutagenesis screen, which led us to identify three proteins secreted from dense granules, TGGT1_226380 (GRA35), TGGT1_237015 e TGGT1_236870, which are individually involved in NLRP1 inflammasome activation and pyroptosis induction. Deletion of these proteins (by CRISPR/CAS9) results in significantly less pyroptosis in Lewis macrophages. A more detailed search of the clones generated by the mutagenesis assay reveals that additional factors may be involved in the induction of pyroptosis. As GRA35 family is composed by three other genes (TGGT1_225160, TGGT1_213067, TGGT1_257970) we decided to test the involvement of these proteins in pyroptosis induction. Deletion of these genes in T. gondii does not alter the viability of Lewis BMDMs compared to WT strain, which shows that, unlike GRA35, these proteins are not involved in the activation of NLRP1 inflammasome and induction of pyroptoisis. In conclusion, we demonstrate that dense granule proteins are an essential part for the parasite survival within the parasitophorous vacuole, controlling the transport of molecules through the PV membrane, as well as for being recognized by the host innate sensors, initiating a response that control the protozoan, through inflammasome activation and pyroptoisis induction.CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoFAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas GeraisTese (Doutorado)Os patógenos membros do filo apicomplexa são uma grande ameaça para a saúde humana e animal no mundo. O Toxoplasma gondii é um dos protozoários pertencente a esse filo, capaz de infectar qualquer célula nucleada. Por ser um protozoário intracelular obrigatório, a entrada na célula hospedeira é um processo fundamental para a sua sobrevivência. A invasão é um processo ativo durante a qual o parasito recruta parte da membrana da célula hospedeira para formar o vacúolo parasitóforo (VP). Apesar da importância da VP em proteger o parasito da eliminação pelas células hospedeiras, a membrana do vacúolo parasitóforo (MVP) forma uma barreira que priva o parasito de uma vasta fonte de nutrientes do sistema endocítico e exocítico do hospedeiro. Para contornar esse problema, o parasito secreta proteínas que se associam a MVP, alterando a sua permeabilidade, possibilitando assim a difusão passiva, bidirecional, de moléculas pequenas, através de poros na membrana do VP. Por outro lado, as células hospedeiras são capazes de reconhecer moléculas parasitárias em contato com suas membranas ou que são lançadas para dentro de seu citoplasma, induzindo a ativação de mecanismos cruciais para a sua resistência frente a infecção. Até o momento, as bases moleculares da formação do poro hipotético ainda não foram relatadas, bem como há pouco conhecimento sobre as moléculas do parasito que são agonistas de receptores inatos, sendo estes os objetivos centrais de investigação deste trabalho. Em uma primeira abordagem, GRA17 foi identificada como uma proteína secretada para a MVP que medeia o transporte de pequenas moléculas através da MVP, sendo que sua deleção induz lenta proliferação parasitária e queda abrupta de virulência em camundongos. Apesar da predição de múltiplas estruturas alfa (α)-hélice na composição de GRA17, esses ainda não foram funcionalmente caracterizados. No primeiro capítulo deste trabalho, predizemos oito domínios α-hélices para GRA17, que foram individualmente truncados utilizando o sistema Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR/ CRISPR associated protein 9-CAS9 (CRISPR/CAS9), com o intuito de se caracterizar funcionalmente esses domínios. Por meio desta abordagem, demonstramos que, com exceção do motivo α-8, todos os demais são indispensáveis para ação, localização proteica e estabilidade do VP. O truncamento desses 7 motivos resulta em falhas na localização de GRA17 na MVP e surgimento de vacúolos parasitóforo aberrantes. Além disso, a deleção das 7 sequências α-hélices resulta em uma drástica diminuição na proliferação e sobrevivência do parasito, nos levando a conclusão de que as estruturas α-hélice de GRA17 são cruciais para função proteica e consequente viabilidade do parasito. Por outro lado, buscamos compreender os mecanismos de resistência do hospedeiro decorrentes da liberação de antígenos durante o processo de replicação. Com tal intenção, utilizamos modelo estabelecido em ratos da linhagem Lewis, que resulta na total eliminação do parasito. Estudos anteriores demonstraram que essa resistência é mediada pela ativação do receptor inato citoplasmático NLRP1, que resulta na rápida morte da célula hospedeira através da piroptose, limitando a replicação parasitária. Até o momento, não foram identificados os alvos antigênicos envolvidos na ativação de NLRP1. Para identificar os genes parasitários que induzem a ativação desta via, utilizamos um ensaio de mutagênese química que nos levou a identificar três proteínas secretadas de grânulos densos, TGGT1_226380 (GRA35), TGGT1_237015 e TGGT1_236870, que individualmente estão envolvidas na ativação de NLRP1 e indução de piroptose. A deleção dessas proteínas por CRISPR/CAS9 resulta na inibição da piroptose em macrófagos oriundos de rato Lewis. Uma busca mais detalhada dos clones gerados pelo ensaio de mutagênese revela que fatores adicionais podem estar envolvidos na indução de piroptose. Como a família da GRA35 é composta por três outros genes (TGGT1_225160, TGGT1_213067, TGGT1_257970), decidimos investigar o envolvimento dessas proteínas na indução de piroptose. A deleção desses genes em T. gondii não alteram a taxa de viabilidade de BMDMs de Lewis em comparação com a cepa WT, o que demonstra que, diferentemente da GRA35, essas proteínas não estão envolvidas na ativação do inflamassoma de NLRP1 e indução de piroptose. Em conclusão, demonstramos que as proteínas de grânulos densos são parte essencial dos mecanismos de sobrevivência dentro do vacúolo parasitóforo, controlando o transporte de moléculas através da membrana do VP, bem como são reconhecidas pelos sensores inatos do hospedeiro, iniciando a montagem de uma resposta de controle contra o protozoário, mediada pela ativação do inflamassoma e indução de piroptose