Computacional analysis of the chromatin of fowl s spermatozoa (Gallus gallus) and determination of the storage time of spermatozoa in the sperm storage tubules in fowl hens

The objectives of this work were to evaluate new methodological variants using toluidina blue (AT), to establish a trustworthy protocol for the computational evaluation of the chromatin compaction of the fowl s spermatozoa, to find out alterations in the chromatin compactation during the storage in the sperm storage tubules of fowl hens, to observe the storage time and to estimate the variation in the amount of stored spermatozoa in the cranial, medium and caudal sections of the uterovaginal junction during 23 days. Twenty semen samples were used: 10 from fowls that were 35 weeks old and had high fertility (young fowls) and 10 from fowls that were 60 weeks and had low fertility (Old fowls). To the analysis of the spermatozoa during the storage in the sperm storage tubules of hens, 48 thirty-six- week-old meat chickens (44 hens and 4 fowls) of the Cobb Avian 48 strain were also used. A sample from the uterovaginal junction of the hens was collected for 23 days after the match with the fowls, 6 hens being sacrificed every four days to make histological microscope slides. Different methods of denaturation and staining were tested. The best method with AT was the hydrolysis with 1N HCl for 10 minutes, staining in bucket with 0.025% AT, pH 4,0, for 20 minutes, dehydration in alcohol, clearing in xylol and mounted with Canada balsam. All the semen samples were submitted to this protocol and later evaluated through computational image analysis. Area, length, width, perimeter and the chromatin compaction homogeneity of head spermatozoa were measured. The sperm of old fowls presented more chromatin changes than the ones of young fowls. The spermatozoa of the young fowls presented bigger heads than the ones of old fowls. It was not possible to determine the chromatin compaction alterations of the fowl sperm after their storage in the sperm storage tubules through the used method. Spermatozoa were found through out the area of the sperm storage tubules. Most of then gathered in the medium section of the uterovaginal junction. There was not meaningful statistical difference in the amount of sperm in the sperm storage tubules over the days of the experiment. A greater amount of sperm cells were observed until the 23rd day of assessment. Therefore, the storage time of the spermatozoa in hens lasts at least 23 days.Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas GeraisMestre em Ciências VeterináriasOs objetivos desse trabalho foram testar novas variantes metodológicas utilizando coloração com azul de toluidina, até se estabelecer um protocolo confiável para a avaliação computacional da compactação da cromatina em espermatozóides de galo, buscar alterações na compactação da cromatina durante o armazenamento dos mesmos na espermateca de galinhas, observar a duração do período de armazenamento e estimar a variação na quantidade de espermatozóides armazenados nos segmentos cranial, médio e caudal da região da espermateca durante 23 dias. Para avaliação computacional da compactação da cromatina, foram utilizadas 20 amostras de sêmen de galo, sendo 10 amostras de galos com 35 semanas de idade (Galos Novos) e 10 amostras de galos com 60 semanas de idade (Galos Velhos). Para a análise dos espermatozóides durante o armazenamento nas espermatecas das galinhas, foram utilizadas 48 matrizes pesadas (44 fêmeas e 4 machos) da linhagem Cobb avian 48 com 36 semanas de idade. Foi coletado material da junção utero-vaginal das fêmeas por 23 dias após a cópula com os machos, sendo que a cada 4 dias, 6 fêmeas foram sacrificadas para confecção de lâminas histológicas da região da espermateca. Foram testados diferentes métodos de desnaturação e coloração com AT, sendo que o melhor foi a hidrólise com ácido clorídrico 1N por 10 minutos, coloração em cubeta com azul de toluidina 0,025%, pH 4,0, por 20 minutos, desidratação em álcool, diafanização em xilol e montagem com bálsamo do Canadá. Todas as amostras de sêmen foram submetidas a este protocolo e posteriormente avaliadas por análise de imagem computacional, onde foram mensuradas as cabeças dos espermatozóides quanto a área, comprimento, largura, perímetro, homogeneidade da compactação da cromatina dentro de cada cabeça e intensidade de compactação da cromatina. Os espermatozóides de galos velhos apresentaram mais alterações na cromatina do que os de galos jovens. Os galos jovens apresentaram cabeças de espermatozóides maiores do que galos velhos. Não foi possível determinar as alterações na compactação da cromatina dos espermatozóides dos galos após o armazenamento na espermateca pelo método utilizado. Foram encontrados espermatozóides por toda a extensão das espermatecas, sendo que esses se concentravam no segmento médio da junção utero-vaginal. Não houve diferença estatística significativa na quantidade de espermatozóides presentes na espermateca no decorrer dos dias de experimento. Foram observadas grandes quantidades de células espermáticas até o 23º dia de coleta. Portanto, o período de armazenamento de espermatozóides em galinhas é de, no mínimo 23 dias