Avaliação de frações hidrofóbicas e hidrofílicas de brucella abortus em ensaios imunoenzimáticos para caracterizar o perfil de anticorpos produzidos por bovinos vacinados e não-vacinados

Brucella abortus hydrophobic and hydrophilic fractions obtained from smooth lipopolysaccharide (S-LPS) and Triton X-114 extractions, respectively, were evaluated in immunoassays in order to characterize the antibody response of B. abortus S19 vaccinated heifers and non-vaccinated seropositive cows. Indirect enzyme immunoassays (iELISAs) using Protein A or anti-bovine IgG as peroxidase conjugates as well as immunoblot and avidity-immunoblot were used. Four groups with 15 cattle sera each were analyzed: (I) non-vaccinated seropositive cows from Brucella-endemic areas; (II) non-vaccinated seropositive cows from Brucella non-endemic areas; (III) S19 vaccinated heifers from Brucella-endemic areas; and (IV) non-vaccinated seronegative cows from Brucella non-endemic areas. Traditional agglutination tests were compared to iELISAs. A threshold ELISA index (EI) value for a result to be considered positive was selected through two-graph receiver operating characteristic (TG-ROC) analysis. iELISAs were more able to identify vaccinated heifers as negative animals (87%) in relation to classical agglutination tests (13%). Levels of IgG antibodies to B. abortus S-LPS were higher in non-vaccinated seropositive cows (groups I and II) when Protein A/peroxidase was used, reflecting in predominance of IgG2 antibodies. Avidity-immunoblot with B. abortus Triton X-114 hydrophilic fraction showed significant reactivity impairment for the immunodominant antigenic bands (57, 43 and 35 kDa) recognized by sera of vaccinated heifers, reflecting in lower vaccinal antibody avidity for such antigenic markers. In conclusion, iELISAs with B. abortus S-LPS using Protein A/peroxidase showed to be a potential tool for discriminating S19 vaccinal responses from B. abortus infection due to a preferential detection of IgG2 subclasses. Also, B. abortus-specific IgG reactivity profile in avidity-immunoblot demonstrated that vaccinal antibodies showed a lower avidity for antigenic components with apparent molecular masses of 57, 43 and 35 kDa, thus representing potential antigenic markers to differentiate vaccinated from naturally infected cattle.Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas GeraisMestre em Imunologia e Parasitologia AplicadasFrações hidrofóbicas e hidrofílicas de Brucella abortus, obtidas a partir da extração de lipopolissacarídeos de formas lisas (S-LPS) e por detergente não-aniônico (Triton X-114), respectivamente, foram avaliadas em ensaios imunoenzimáticos com o objetivo de caracterizar o perfil de anticorpos produzidos por bovinos vacinados com B. abortus S19 e animais soropositivos não-vacinados. Foram empregados o teste imunoenzimático indireto (iELISA), utilizando-se Proteína A ou anti-IgG bovina marcadas com peroxidase como conjugados, bem como os testes immunoblot e immunoblot-avidez. Quatro grupos de 15 amostras de soros bovinos previamente analisados por testes tradicionais de aglutinação foram estudados: (I) bovinos soropositivos não vacinados procedentes de área endêmica para Brucella; (II) bovinos soropositivos não vacinados procedentes de área não endêmica para Brucella; (III) novilhas vacinadas com B. abortus S19 e procedentes de área endêmica; e (IV) bovinos soronegativos não vacinados procedentes de área não endêmica. O valor limiar do índice ELISA (IE) para ser considerado como um resultado positivo foi selecionado mediante a análise TG-ROC (two-graph receiver operating characteristic). Os testes iELISA foram mais capazes de identificar novilhas vacinadas como animais negativos (87%) em relação aos testes clássicos de aglutinação (13%). Níveis de anticorpos IgG anti-S-LPS de B. abortus foram maiores em bovinos não vacinados soropositivos (grupos I e II) quando Proteína A/peroxidase foi empregada, refletindo uma predominância de anticorpos da subclasse IgG2. Immunoblot-avidez utilizando a fração hidrofílica Triton X-114 de B. abortus revelou uma significativa queda de reatividade para bandas antigênicas imunodominantes (57, 43 e 35 kDa) reconhecidas por amostras de soros de novilhas vacinadas, refletindo a presença de anticorpos vacinais de baixa avidez para estes marcadores antigênicos. Pode-se concluir que o teste iELISA com S-LPS de B. abortus utilizando Proteína A/peroxidase como conjugado demonstrou ser uma importante ferramenta para diferenciar a síntese de anticorpos induzida pela resposta à vacina S19 em comparação com a síntese induzida pela infecção natural, devido à detecção preferencial da subclasse IgG2. Além disso, o perfil de reatividade de anticorpos IgG específicos para B. abortus por immunoblot-avidez demonstrou que anticorpos vacinais apresentaram baixa avidez para componentes com massa molecular aparente de 57, 43 e 35 kDa, constituindo-se em potenciais marcadores antigênicos para diferenciar bovinos vacinados dos animais com infecção natural