Proudução de lipase por Candida rugosa e Geotrichum candidum empregando melaço de soja

Lipase (EC 3.1.1.3), an enzyme that hydrolyses the esters in glycerol, is often used for biotechnological and industrial applications. Candida rugosa and Geotrichum candidum lipases are known to have characteristics such as broad substrate specificity, tolerance toward organic solvents and high thermal stability. These characteristics permit the lipase to be used as a biocatalyst in industrial applications that are performed at elevated temperatures or in the presence of organic solvents. In this way, the present work describes the production of lipase by Candida rugosa and Geotrichum candidum in a culture supplemented with soybean molasses. After optimizing the fermentation times for both microorganisms, the effects of changing the soybean molasses concentration, the fermentative environment pH and the fermentation temperature were evaluated. When soybean molasses was used at a concentration of 200 g/L at 25 ºC, the lipolytic activity measured in the broth was 5.25 U/mL after 12 hours for Candida rugosa and 6.25 U/mL after 24 hours for Geotrichum candidum. Central composite planning (CCP) was used to define the optimal combination of soybean molasses concentration, initial environmental pH and fermentation temperature. This analysis determined that, in a medium containing 200 g/L soybean molasses at pH 3.5 ± 0.1 and a fermentation temperature of 27 ± 1 °C, the lipase activity increased by an average of 2.12 U/mL for Candida rugosa, representing an increase of 129% compared with the activity obtained in preliminary tests, and 11.48 U/mL for Geotrichum candidum, representing an increase of 84% compared with the activity obtained in preliminary tests. Furthermore, microbial lipases are usually purified with polymer/polymer and polymer/salt ATPSs (Aqueous two-phase systems). The findings of these purification experiments were promising, suggesting that the polymer/polymer and polymer/salt ATPSs could potentially be adopted for industrial-scale operation. ATPSs have achieved desired purification of lipases derived from microbial sources in less time than conventional multi-step downstream. The present work describes the purification of lipase derived from Candida rugosa and Geotrichum candidum, produced in a culture supplemented with soybean molasses. Alcohol/salt-based aqueous two-phase systems (ATPSs) were used to recover these lipases. Six biphasic systems, comprised of an alcohol-based top phase (ethanol and 2-propanol) and a salt-based bottom phase (potassium phosphate, sodium citrate and ammonium sulfate), were evaluated for their effectiveness in lipase recovering. The stability of lipase in each of the solutions was tested. From the results obtained in preliminary tests was held Central Composite Planning (CCP) in order to optimize the purification of lipases by ATPS. The optimum partition efficiency for purification of lipase for both micro-organisms was obtained in an ATPS of 20% (w/w) 2-propanol and 20% (w/w) potassium phosphate. The Candida rugosa lipase purified had a mean selectivity of 292.54, mean purification factor of 12.13 and a mean yield of 95.57%, while for Geotrichum candidum lipase purified had a mean selectivity of 272.78, mean purification factor 11.40 and a mean yield of 95.70%.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoMestre em Engenharia QuímicaLipase (EC 3.1.1.3), é uma enzima que hidrolisa os ésteres de glicerol, é muitas vezes utilizadas em aplicações biotecnológicas e industrial. Lipase de Candida rugosa e Geotrichum candidum são conhecidas por ter características tais como ampla especificidade em substratos, tolerância em relação aos solventes orgânicos e de elevada estabilidade térmica. Estas características permitem que a lipase seja utilizada como um biocatalisador em aplicações industriais que são realizadas a temperaturas elevadas ou na presença de solventes orgânicos. Desta forma, o presente trabalho estuda a produção de lipase por Candida rugosa e Geotrichum candidum num meio de cultura composto por melaço de soja. Após otimizar o tempo de fermentação para ambos micro-organismos, foram realizados testes variando a concentração de melaço de soja, o pH do meio fermentativo e a temperatura de fermentação. Quando utilizou-se melaço de soja numa concentração de 200 g/L à 25°C, a atividade lipolítica medida no caldo, foi 5.25 U/mL após 12 horas para Candida rugosa e 6.25 U/mL após 24 horas para Geotrichum candidum. Um Planejamento Composto Central (PCC) foi definido variando-se a concentração de melaço de soja, o pH inicial do meio e a temperatura de fermentação. Concluiu-se que o meio composto de 200 g/L de melaço de soja em pH de 3,5 ± 0,1 e a temperatura de fermentação em 27 ± 1°C, a atividade de lipase aumentou, em média, 12.02 U/mL para a Candida rugosa, o que representou um aumento de 129% em relação à atividade obtida nos testes preliminares, e 11,48 U/mL para o Geotrichum candidum, representando um aumento de 84% em relação à atividade obtida nos testes preliminares. Lipases microbianas são usualmente purificadas com Sistemas Aquosos Bifásicos (SABs) compostos por polímero/polímero, polímero/sal ou álcool/sal. Os resultados obtidos com experimentos de purificação são bastante promissores, sugerindo que estes SABs poderiam ser adotados para aplicação em escala industrial. SABs têm alcançado uma purificação desejada de lipases, derivadas de fontes microbianas, sendo necessário também menos tempo do que os métodos convencionais que necessitam de várias etapas anteriores. Este trabalho, também descreve a purificação das lipases derivadas de Candida rugosa e Geotrichum candidum, produzida em melaço de soja. O SAB utilizado para a recuperação destas lipases foi composto por álcool/sal-básico. Seis sistemas bifásicos, compostos por álcool (etanol e 2-propanol) na fase superior, e um sal-básico (fosfato de potássio dibásico, citrato de sódio e sulfato de amônio), foram avaliados quanto à sua eficácia na recuperação da lipase. A estabilidade da lipase em cada uma das soluções foi testada. A partir dos resultados obtidos em testes preliminares realizou-se um Planejamento Composto Central (PCC), a fim de otimizar a purificação das lipases por SAB. A eficiência máxima de partição para a purificação de lipase para ambos os micro-organismos foram obtidas no SAB contendo 20% (p/p) de 2-propanol e 20% (p/p) de fosfato de potássio. A lipase de Candida rugosa purificada apresentou uma seletividade média de 292,54, um fator de purificação médio de 12,13 e um rendimento médio de 95,57%, enquanto a lipase de Geotrichum candidum purificada apresentou uma seletividade média de 272,78, um fator de purificação médio de 11,40 e um rendimento médio de 95,70%