Papel de HSP70 de Toxoplasma gondii como antígeno vacinal e como ferramenta diagnóstica de toxoplasmose em camundongos BALB/c e C57BL/6

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan parasite of warm-blooded animals that can express the heat shock protein of 70 kDa (TgHSP70) during stage conversion. TgHSP70 is a highly antigenic protein and its presence indicates a danger signal to the host. The aim of this work was to verify the role of TgHSP70 as an alternative tool for active toxoplasmosis diagnosis, detecting the protein, specific antibodies and immune complexes (IC) in the experimental infection with T. gondii. Also, we observed the localization of this protein in T. gondii tachyzoites and its role in immunization procedures. Recombinant TgHSP70 was purified from E. coli and used to immunize chickens and Calomys callosus in order to produce specific antibodies anti-TgHSP70. It was observed by immunofluorescence that TgHSP70 is present in the cytoplasm of tachyzoites and could be associated to the inner layer of plasma membrane. It was also demonstrated by immunoblotting and ELISA that this protein is not secreted by T. gondii. Immunization of BALB/c and C57BL/6 mice only with TgHSP70 did not induce protection to challenge with ME-49 and RH strains of T. gondii after 30 of the last immunization. However, it was observed that spleen cells of non-immunized mice proliferate when stimulated in vitro with TgHSP70, indicating unspecific stimulation effect. Moreover, BALB/c and C57BL/6 mice were infected with T. gondii ME-49 strain and treated with dexamethasone (DXM) for toxoplasmosis reactivation. C57BL/6 mice treated with DXM presented higher parasite load in the brain than treated BALB/c mice. In addition, the treatment reduced the inflammatory changes in the brain of both lineages, although, these lesions were higher in C57BL/6 mice. It was verified by qPCR that infection induces TgHSP70 expression in the brain mainly in C57BL/6 mice, and also increases the specific protein concentration in sera from both lineages, but only leads IC formation in BALB/c mice. Finally, these data suggest that circulating TgHSP70 could be used as diagnostic tool for active infection in susceptible C57BL/6 mice and also that TgHSP70, in the other hand, could be used as adjuvant in immunization procedures.Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas GeraisMestre em Imunologia e Parasitologia AplicadasToxoplasma gondii é um parasita intracelular obrigatório de animais homeotérmicos que expressa a proteína de choque térmico de 70 kDa (TgHSP70) durante a conversão de estágios. TgHSP70 é uma proteína com elevado potencial antigênico e sua presença no curso da infecção é um sinal de perigo para o hospedeiro. O objetivo deste trabalho foi avaliar o papel da TgHSP70 como ferramenta alternativa para o diagnóstico de toxoplasmose ativa, detectando a proteína, anticorpos específicos e complexos imunes (CI) circulantes em infecção experimental pelo parasita. Além disso, avaliamos a localização da proteína em taquizoítas de T. gondii e o papel dessa como antígeno vacinal. Deste modo, TgHSP70 recombinante foi purificada de E. coli e foi utilizada na imunização de galinhas e Calomys callosus para produção de anticorpos específicos anti-TgHSP70. Foi observado por imunofluorescência que TgHSP70 esta presente no citoplasma de taquizoítas e que esta pode estar associada com a membrana plasmática interna, sendo demonstrado por immunoblotting e ELISA que TgHSP70 não é secretada por T. gondii. A imunização de camundongos BALB/c e C57BL/6 com TgHSP70 apenas, não induziu proteção quando esses animais foram desafiados 30 dias após com as cepas RH ou ME-49 de T. gondii. Foi observado também que células de baço de animais não imunizados proliferam in vitro quando estimuladas com TgHSP70. Além disso, para verificar a presença de reativação da toxoplasmose, camundongos BALB/c e C57BL/6 foram infectados com a cepa ME-49 de T. gondii e tratados com dexametazona (DXM). Foi observado que animais C57BL/6 tratados com DXM apresentaram carga parasitária e alterações histológicas no cérebro aumentadas em relação aos camundongos BALB/c tratados, embora a inflamação tenha sido menor em ambas as linhagens quando comparado aos animais infectados e não tratados. Detectamos também por qPCR que a infecção induziu a expressão de TgHSP70 no cérebro dos animais, sendo maior no órgão dos camundongos C57BL/6, e também aumentou a concentração de TgHSP70 circulante no soro de ambas as linhagens e maior indução de anticorpos específicos e formação de CI em camundongos BALB/c. Por fim, estes dados sugerem que TgHSP70 circulante pode ser utilizada como ferramenta diagnostica de infecção ativa em camundongos C57BL/6, sendo que essa infecção é persistente nesses animais e que a TgHSP70, por outro lado, poderia ser utilizada como adjuvante em experimentos de imunização