Da fertilização à criopreservação dos embriões de bovino : fatores condicionantes e a sua otimização

Dissertação de Mestrado, Engenharia Zootécnica, 15 de junho de 2018, Universidade dos Açores.A produção de embriões de bovino in vitro é a chave para o desenvolvimento do setor agropecuário a nível mundial. No entanto, comparativamente com outros setores, ou até mesmo outros ramos da agropecuária, a produção in vitro de embriões ainda é uma dificuldade nesta área. Esta dificuldade está relacionada com os diferentes fatores que afetam esta técnica nas suas diferentes etapas: recolha e maturação dos ovócitos; recolha e capacitação do sémen; fertilização e cultura dos embriões fertilizados. Contudo, diferentes investigadores têm-se dedicado à resolução dos diferentes problemas que surgem ao longo do seu desenvolvimento, de forma a otimizar todo o processo. De uma forma geral, esses problemas estão relacionados com a manutenção da integridade dos gametas após a sua colheita, proporcionamento das condições ótimas de maturação, fertilização e posterior desenvolvimento embrionário. Todas estas etapas são suportadas por diferentes meios, em que a sua otimização passa pelo incremento da sua qualidade e similaridade com o ambiente in vivo. Todo este processo passa-se essencialmente pela adição de diferentes compostos nas quantidades fisiológicas, bem como as condições ambientais adequadas. Quanto à maturação, estes compostos vão desde diferentes hormonas até agentes antioxidantes. Na etapa seguinte, a fertilização, para além da capacitação espermática adequada, a otimização passa também pela potencialização dos meios, de modo a que estes permitam a junção entre gametas, tal como o desenvolvimento embrionário ao longo de toda a sua cultura. De entre os inúmeros estudos desenvolvidos, no que diz respeito à adição de diferentes compostos aos meios, os mais recentes passam pela adição de diferentes aminoácidos, como é o caso da L-Arginina, que está relacionada com a inibição do desenvolvimento da apoptose nas células embrionárias, de diferentes antioxidantes, como a crócina, como também de moléculas recetoras como CaSr (Recetor sensor de cálcio), e até mesmo na modificação dos diferentes métodos de avaliação morfológica dos embriões, que passa não só pela observação microscópica como também pela sua medição. Após o desenvolvimento dos embriões em laboratório, o meio científico depara-se com mais um problema, a viabilidade após criopreservação destes embriões. Tal dificuldade é apontada essencialmente pela excessiva acumulação lipídica em embriões de bovino produzidos in vitro, em resultado da adição de macromoléculas aos meios de cultura. Contudo, ao contrário do que tem vindo a ser descrito, a sua presença é essencial. No entanto esta deve ser em quantidades reduzidas. O processo pelo qual se dá essa excessiva acumulação não está completamente definido, no entanto, existem trabalhos que apontam para a incompleta maturidade das mitocôndrias que não degradam os lípidos. Porém esta excessiva acumulação interfere no processo de congelação dos embriões, mais propriamente na fase de transição lipídica. No sentido de aumentar a viabilidade embrionária após criopreservação, diferentes autores têm demostrado que esta pode ser realizada através da adição de alguns agentes lipídicos aos meios, como é caso do ácido linoleico conjugado (CLA) e do Forskolin, onde se nota uma redução lipídica aquando da sua presença nos meios de cultura. Isto através da estimulação da lipólise pelos mesmos. No entanto, todos os processos de fertilização in vitro não dispensam a rigorosidade da manipulação de todo o material, biológico e não biológico, em cada etapa, nem de assépcia ao longo de todo o processo. Por fim, para que todos os avanços sejam promissores no sector agrícola, há que dar o passo para a industrialização, que passa pela avaliação da adição dos diferentes elementos, a longo prazo.ABSTRACT: The in vitro production of embryos is the key for the development of the agricultural field in the world. However, when compared with other sectors, the in vitro production of embryos is yet a dilemma in this area. It is related with different factors that affect this technique in different steps: oocyte collection and maturation; semen collection and capacitation; fertilization and culture of embryos fertilization. Despite that, different scientist are trying to understand the problems that appears during the development, with the objective to optimize all of process. Generally these problems are related with maintenance of the integrity of the gametes after collection, providing excellent maturation, fertilization and subsequent embryonic development conditions. All of these steps are supported by different mediums, which are optimized by increasing the quality and it’s similarity with in vivo environment. All of this process pass, essentially, by adiction of different compounds in physiological quantities, as well as the appropriate environment condittions. Regarding maturation, this compounds goes from different hormones to antioxidant agents. In the next step, fertilization, despite the correct espermatic capacitacion, the optimization also pass by the enhancement of the mediums, allowing the junction between the gametes, like a embryonic development along all culture. Among the innumerable studies developed, regarding the addition of different compounds into the medium, the most recent is the addition of different amino acids, like a L-arginine, which is related with the inhibition of apoptosis development in embryonic cells, different antioxidants, like Cronin, also receptor molecules, as a CaSr (Calcium Detection Receptor) and even in the modification of differents methods of morphological evaluation of embryos, which it does not pass only by microscopic observation, but also by its measurement. After the embryonic development of embryos in the lab, the scientific milieu have one more problem, the viability of the embryos after cryopreservation. This difficulty is essentially caused by the excessive lipid accumulation in in vitro bovine embryos, in result of the addition of macromolecules into culture medium. However, against what has been described, its presence is essential but it must be in reduced quantities. The process regarding this excessive accumulation is not completely defined, although, there are articles that point to the incomplete maturity of mitochondria that does not degrade the lipids. This excessive acumulation interfere with embryo freezing process, more properly in the lipid transition phase. With the objective to increase the embryonic viability after criopreservation, different authors have demonstrated that it can be performed by the addition of some lipolytic agents into the medium, such as CLA (Conjugated Linoleic Acid) and Forskolin, where a lipid reduction is noted upon its presence in the culture media, by the stimulation of lipolysis. However, all process of in vitro fertilization does not exclude the rigorous handling of all material, both biological and non-biological, in each step, and does not exclude the hygiene throughout the entire process. Despite all, advances are promising in agricultural field, and we must take a step to the industrialization, which passes by the evaluation of adding different compounds, in longterm