Caracterização molecular do gene TEX11 em homens azoospérmicos

Dissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2018A investigação dos determinantes genéticos da fertilidade masculina nos últimos anos tem-se concentrado principalmente na análise do genoma humano por microarray e, mais recentemente, na sequenciação do exoma por sequenciação de nova geração (NGS). Apesar dos esforços realizados, não têm sido detetadas alterações genómicas específicas nem alterações pontuais patogénicas, com com elevada frequência , associadas à patologia em causa. Recentemente foi identificado o gene TEX11 localizado em Xq13.1, no âmbito do qual um número reduzido de estudos demonstra a sua importância para a fecundidade/gametogénese masculina. Esses estudos moleculares, realizados em amostras de homens inférteis, selecionados de acordo com parâmetros espermáticos, identificaram alterações com frequências que variam entre de 1 a 15%. Complementarmente, foi também demonstrado que certas alterações estão associadas a paragem da meiose no estágio de paquíteno, não tendo sido observados espermatídios redondos ou espermatozóides maduros nos túbulos seminíferos. A proteína TEX11 intervém na formação do complexo sinaptonémico e no estabelecimento dos pontos de quiasma no crossing-over cromossómico durante a meiose. Dado o conhecimento atual e a importância/função do gene em questão e porque não há estudos na população portuguesa sobre este gene, este projeto visou analisar a nível molecular o gene TEX11 em homens azoospérmicos e avaliar as suas consequências para a fertilidade masculina. Para este fim, a estratégia de análise molecular compreendeu: i) otimização da PCR simples para os 29 exões do gene em questão; ii) otimização de PCR múltiplas para os diversos exões do TEX11 visando a pesquisa de deleções; iii) pesquisa de alterações moleculares no gene em causa por sequenciação de nova geração (usando os produtos das PCR múltiplas), visando a identificação de alterações moleculares que possam afetar a função do gene/proteína; iv) avaliação das consequências funcionais de alterações detetadas através de análise in silico; v) estabelecimento de correlações genétipo/fenótipo; vi) pesquisa das alterações potencialmente patogénicas em homens férteis, detetadas no âmbito ponto iii); vii) confirmação destas alterações através da PCR simples e posterior sequenciação de Sanger. Através desta abordagem foi possível analisar 85 homens azoospérmicos, tendo sido também incluídas três amostras controlo, dois homens normozoospérmicos e uma mulher. Detetaram-se 27 alterações em sequências flanqueadoras dos exões ou nos próprios exões, as quais, após análise in silico e avaliação da sua frequência em bases de dados e publicações científicas (HGMD; 1000 Genomes), culminaram com a seleção de 5 alterações presumivelmente patogénicas/provavelmente patogénicas devido a poderem afetar o processamento (splicing) do respetivo mRNA. Embora três destas alterações possam perturbar o splicing, dada a sua frequência na população é possível que não estejam associadas a consequências funcionais graves correspondendo a polimorfismos. Obteve-se assim, uma taxa de deteção de alterações com potencial patogénico de 2,5% (2/79), sendo ambas alterações sinónimas: c.924C>T (p.Gly314=) e c.450C>T (p.Ala150=), que ocorrem com baixa frequência (T (p.gly314=) and c.450C>T (p.Ala150=), occurring with low frequency (